陳思名，白俊

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710068)

0 引言

CAR-T 細(xì)胞免疫治療是一種利用抗腫瘤免疫力進(jìn)行癌癥治療的免疫治療新方法。與傳統(tǒng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相比，CAR-T 具有改良的腫瘤抗原特異性和單鏈抗體產(chǎn)生的不依賴主要組織相容性復(fù)合分子的細(xì)胞毒性[1]。CAR-T 細(xì)胞已證實(shí)主要在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中有效，CD19 導(dǎo)向的CAR-T細(xì)胞治療在晚期化療耐藥的白血病和淋巴瘤患者中已顯示出令人印象深刻的臨床反應(yīng)[2]。美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA) 批準(zhǔn)了兩種靶向CD19CAR-T 治療藥：Yescarta?和Kymriah?用于復(fù)發(fā)性或難治性侵襲性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者[3,4]。隨著近年來實(shí)體腫瘤的發(fā)生率的升高，CAR-T 療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療方面的取得的成功使得越來越多的臨床研究致力于將其擴(kuò)大至實(shí)體瘤在內(nèi)的其他癌癥的治療中。

1 嵌合抗原受體T 細(xì)胞(CAR-T)簡介

嵌合抗原受體(CAR)是將識別腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociated antigen，TAA)的單鏈抗體(singlechain variable fragment，scFv)和T 細(xì)胞的活化序列在體外進(jìn)行基因重組形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至經(jīng)純化和大規(guī)模擴(kuò)增的T 細(xì)胞，產(chǎn)生所謂的CAR-T 細(xì)胞。CAR-T 細(xì)胞能夠以不依賴MHC 分子限制的方式識別腫瘤細(xì)胞上的特定靶標(biāo)，誘導(dǎo)持久的抗腫瘤反應(yīng)[5]。該特性也可有效防止腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)MHC 的表達(dá)導(dǎo)致免疫逃逸的發(fā)生[6]。

通過不斷探索和改善細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的作用，已經(jīng)產(chǎn)生了四代CAR-T 細(xì)胞。第一代CAR 僅包含一個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域CD3ζ 以提供信號[7]。因此CAR-T 細(xì)胞活性差，體內(nèi)存活時(shí)間短。第二代和第三代CAR 則在第一代CAR 基礎(chǔ)上，分別合并一個(gè)或兩個(gè)共刺激信號域如CD28 或4-1BB(CD137)[8]使得CART 細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。第四代CART 細(xì)胞也稱為“TRUCK”細(xì)胞，其加入了細(xì)胞因子或共刺激配體能夠在腫瘤中分泌特定的細(xì)胞因子(如IL-12)，從而改變腫瘤的微環(huán)境并募集激活其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[9]。CAR-T 細(xì)胞上的CAR 分子具有四個(gè)主要組成部分：抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

1.1 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域

抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是CAR 的胞外部分，可識別靶抗原并相應(yīng)地重定向表達(dá)CAR 分子的淋巴細(xì)胞的特異性。CAR 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一個(gè)柔性接頭連接成單鏈抗體(scFv)組成[10]。scFv 序列通常源自鼠或人單克隆抗體，也有利用固有缺乏輕鏈的駱駝科抗體重鏈可變區(qū)(VH)設(shè)計(jì)的單域抗體(納米抗體)[11]。人scFv 噬菌體展示文庫也是scFv 序列的一個(gè)來源[12]。

1.2 鉸鏈區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域

CAR 分子的鉸鏈區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒓?xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。鉸鏈區(qū)提供足夠的柔韌性來克服空間位阻，且具有足夠的長度以利于接近靶抗原?？缒そY(jié)構(gòu)域通常利用如CD3ζ，CD28，CD4 或CD8α 等將CAR分子錨定在T 細(xì)胞膜上。CD3ζ 跨膜結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)CAR 二聚化并摻入內(nèi)源性TCR 中，這可能有助于CAR-T 細(xì)胞活化[13]。

1.3 細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域

細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域通常包含一個(gè)激活域和一個(gè)或多個(gè)共刺激域，主要負(fù)責(zé)信號的活化和傳導(dǎo)，是CAR-T 細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能的“信號開關(guān)”。絕大多數(shù)CAR 分子通過CD3ζ 衍生的免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)激活CAR-T 細(xì)胞。帶有CAR 的T 細(xì)胞除了激活結(jié)構(gòu)域外還需含有共刺激結(jié)構(gòu)域，研究最廣泛的共刺激結(jié)構(gòu)域?yàn)镃D28 或4-1BB(CD137)，利用其設(shè)計(jì)的CAR T 細(xì)胞產(chǎn)品已獲得FDA 批準(zhǔn)[14]。

2 CART 在腫瘤中的應(yīng)用

2.1 CART 在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用

CD19 是目前CAR-T 免疫療法中最具吸引力的靶標(biāo)，表達(dá)CD19CAR 分子的T 細(xì)胞在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了顯著的治療效果，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL) 的完全緩解率高達(dá)90%，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL) 則高達(dá)60% 以上[15]。用于復(fù)發(fā)性或難治性侵襲性非霍奇金淋巴瘤患者的Yescarta?和用于急性淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)患者的Kymriah?已獲美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)[3,4]。在Neelapu 等人[16]進(jìn)行的II 期試驗(yàn)中招募了111 例B 細(xì)胞淋巴瘤患者接受抗CD19 CAR-T 細(xì)胞療法，其客觀反應(yīng)率和完全緩解率分別為82% 和54%。除了ALL 和DLBCL 外，CAR-T 細(xì)胞在其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤的早期臨床試驗(yàn)中也顯示出了希望[17]。

2.2 CART 在實(shí)體瘤中的應(yīng)用

在實(shí)體瘤中進(jìn)行了許多臨床前CAR-T 細(xì)胞免疫治療試驗(yàn)，但其客觀反應(yīng)率不盡相同。在Hou 等[18]的一項(xiàng)針對262 例患者的薈萃分析表明：CAR-T 細(xì)胞療法在實(shí)體瘤中的客觀反應(yīng)率為9%(95%CI：4%-16%)。Louis 等[19]在使用CAR-T 細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)19 名患者中有4名(52.9%)達(dá)到了客觀的臨床反應(yīng)，其中3 名甚至完全緩解。NCT01454596 研究中Goff 等人[20]利用抗EGFRvIII CAR-T細(xì)胞治療淋巴結(jié)清掃術(shù)后復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中1 例生存期達(dá)59 個(gè)月。Wick 等人[21]用抗EGFRvIII CAR-T 細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，10 例患者中無人對此療法有陽性反應(yīng)(包括部分緩解或完全緩解)。在NCT03159819 研究中針對Claudin18.2 的CAR-T 細(xì)胞免疫療法在12 例患者(5例胰腺癌，7 例胃癌)中有1 例完全緩解，3 例部分緩解[22]。在NCT02414269[23]研究中5 例間皮瘤或非小細(xì)胞肺癌胸膜轉(zhuǎn)移患者在接受具有I-caspase-9 安全基因的抗間皮素CAR T 細(xì)胞聯(lián)合抗PD-1 治療后顯示出部分緩解。在晚期膽管癌和胰腺癌中，F(xiàn)eng 等人[24]針對HER2 的CAR T 細(xì)胞進(jìn)行的I期研究對11 例晚期HER2 +(＞ 50%)且接受了紫杉醇和環(huán)磷酰胺化療預(yù)處理的患者進(jìn)行1-2 個(gè)周期HER2CAR-T 細(xì)胞輸注，1 例患者獲得了部分緩解，5 例患者病情穩(wěn)定。

3 CAR-T 在實(shí)體瘤應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)與解決方案

CD19CAR-T 在血液系統(tǒng)腫瘤中表現(xiàn)出令人印象深刻的臨床反應(yīng)，然而CAR-T 細(xì)胞在實(shí)體瘤應(yīng)用中的客觀反映率卻不高。我們分析在使用CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤時(shí)，主要面臨以下三個(gè)挑戰(zhàn)：(1)缺乏特異性的抗原；(2)腫瘤的異質(zhì)性；(3)腫瘤微環(huán)境的影響。

3.1 缺乏腫瘤特異性抗原

大多數(shù)實(shí)體瘤具有上皮起源，很難找到在腫瘤細(xì)胞表面上特異性表達(dá)而在正常上皮細(xì)胞中絕對不表達(dá)的腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)[18]。因此通常會找在腫瘤細(xì)胞上富集但在正常組織中也低水平表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen,TAA) 取而代之[25]。然而靶向TAA 的藥物可產(chǎn)生靶上腫瘤外毒性，這限制了許多CAR T 細(xì)胞產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。在一項(xiàng)針對靶向CAIXCAR-T 細(xì)胞臨床試驗(yàn)中，多名腎細(xì)胞癌患者出現(xiàn)肝酶異常[26]。究其原因在于CAR-T 細(xì)胞滲透到表達(dá)CAIX 的膽管上皮中，且在隨后給予抗CAIX 單克隆抗體后預(yù)防了該種情況的發(fā)生，從而提供了CAR T 細(xì)胞存在靶上腫瘤外毒性的有力證據(jù)。1 例在接受HER2CAR-T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的患者在細(xì)胞輸注后15分鐘出現(xiàn)呼吸窘迫和肺水腫，進(jìn)展為多器官衰竭甚至死亡[27]。據(jù)推測，這種毒性的機(jī)制是通過CAR T 細(xì)胞識別在非惡性肺組織中表達(dá)的HER2 所致。解決CAR-T 細(xì)胞免疫治療安全性的一種方法是利用腫瘤與非惡性組織之間抗原表達(dá)水平的差異而進(jìn)行親和力調(diào)整[28]。使用含較低親和力scFv 的CAR分子可以靶向在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)而在非惡性細(xì)胞上低表達(dá)的抗原，從而確保只有具有高抗原密度的腫瘤細(xì)胞才能提供足夠高的親和力來激活CAR T 細(xì)胞[14]。另一種方案是使用多靶點(diǎn)CART 細(xì)胞減少CART 細(xì)胞對健康組織的結(jié)合[29]。

3.2 腫瘤異質(zhì)性

患者的腫瘤并非全部表達(dá)相同的腫瘤相關(guān)抗原，實(shí)體瘤中CAR-T 細(xì)胞治療的另一個(gè)挑戰(zhàn)是高度的腫瘤異質(zhì)性問題。解決腫瘤異質(zhì)性的可行方法是使用基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)靶向不同抗原的多價(jià)CAR-T 細(xì)胞。如共同靶向CD19 和HER2 的CAR T 細(xì)胞在體內(nèi)顯示出比具有單一靶標(biāo)的CAR-T 細(xì)胞更大的抗腫瘤活性[30]。IL13Rα2 和HER2 特異性的scFv 共同形成雙特異性CAR(TanCAR)可單獨(dú)識別每種抗原以觸發(fā)激活，且在遇到兩種抗原時(shí)其功能會協(xié)同增強(qiáng)[31]。同樣，共同靶向HER2，IL13Rα2 和EphA2 的三價(jià)CAR T 細(xì)胞也可有效清除腫瘤細(xì)胞[32]。另一種多靶點(diǎn)策略是使用柔性接頭將識別CD3 的scFv與識別TAA 的scFv 連接起來，以形成分泌雙特異性抗體(bispecific Tcell engagers, BiTEs)的CAR-T 細(xì)胞。相關(guān)研究已證實(shí)，在白血病和實(shí)體瘤的臨床前模型中，分泌BiTE 的CAR-T細(xì)胞可有效克服抗原表達(dá)的異質(zhì)性并避免抗原逃逸[33]。除此之外靶向與腫瘤異質(zhì)性高度相關(guān)的癌癥干細(xì)胞也是一種方案。CD133 是一種被證實(shí)在許多實(shí)體瘤中過表達(dá)的新型腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，已成為CAR-T 細(xì)胞免疫治療研究的靶標(biāo)之一[34]。

3.3 腫瘤微環(huán)境的影響

腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment ,TME) 是一個(gè)復(fù)雜的腫瘤依賴性環(huán)境，主要由各種細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞，炎性細(xì)胞和脈管系統(tǒng)組成。有研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤的TME 不僅限制了淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸和進(jìn)入實(shí)體瘤的整個(gè)質(zhì)量，而且還下調(diào)了其在腫瘤部位的活性，擴(kuò)增和持久性[35,36]。有研究表明CAR-T 細(xì)胞的局部或瘤內(nèi)應(yīng)用不僅可以在腫瘤部位發(fā)揮有效且持久的抗腫瘤功能、規(guī)避致密的細(xì)胞外基質(zhì)、而且還可以降低脫靶引起的全身毒性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[37]。涉及阻斷TME 中抑制性細(xì)胞Treg 細(xì)胞的分化、清除Treg、逆轉(zhuǎn)Treg 細(xì)胞的免疫抑制作用等抗腫瘤治療方法也成為了研究熱點(diǎn)[1]。

CAR-T 細(xì)胞活化所需的免疫刺激性細(xì)胞因子在實(shí)體瘤微環(huán)境中通常被下調(diào)[38]。由于細(xì)胞因子療法全身遞送的毒性較大，目前已開發(fā)出幾種基于基因編輯的策略來遞送較高局部水平的關(guān)鍵細(xì)胞因子如IL-12，IL-15，IL-18 和IL-21 等來實(shí)現(xiàn)CAR T 細(xì)胞的活化[34]。然而免疫檢查點(diǎn)和可溶性免疫抑制因子在實(shí)體瘤微環(huán)境中卻高度上調(diào)，并會嚴(yán)重影響T細(xì)胞的增殖和功能[39]。將CAR-T 細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用是實(shí)體腫瘤的治療的又一策略。目前NCT03726515研究正在進(jìn)行抗EGFRvIII CAR-T 細(xì)胞與PD-1 抑制劑聯(lián)合用于新診斷的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床試驗(yàn)[34]。然而一些科學(xué)家認(rèn)為，干預(yù)PD-1 基因在T 細(xì)胞中的表達(dá)將不利其存活，并反過來會促進(jìn)幼稚T 細(xì)胞的進(jìn)一步衰竭[40]。

另有一些研究[41,42]還發(fā)現(xiàn)一些microRNA 或者lncRNA 對免疫過程有影響或與之相關(guān)，而對于CART 細(xì)胞治療也是如此。Ji 等人[43]的研究表明microRNA 可以抑制腫瘤細(xì)胞中的某些抑制分子間接增強(qiáng)CAR-T 的細(xì)胞毒性，因此使用包含microRNA的RNA 干擾技術(shù)是應(yīng)對抑制性腫瘤微環(huán)境的的另一種選擇。

4 展望與未來

CAR T 細(xì)胞免疫療法應(yīng)用于實(shí)體瘤開創(chuàng)了實(shí)體瘤免疫治療的新范例。雖然增加CAR 設(shè)計(jì)的復(fù)雜性和T 細(xì)胞的基因編輯可能會放大CAR T 細(xì)胞治療相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，然而通過對基因編輯相關(guān)并發(fā)癥的持續(xù)監(jiān)控將有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)并尋找解決方案。相信在未來，通過基因編輯技術(shù)可以更加有效地改造CAR T 細(xì)胞，為實(shí)體瘤患者提供一種新的治療選擇。