張 偉，王世銀，高 莉，徐夢(mèng)思，王新華*，甘尚權(quán)(. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 83000；. 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 昌吉 8300)

脂肪特異性27 kDa蛋白(Fat specific protein 27, Fsp27)最早在鼠脂肪細(xì)胞系TA1中篩選特殊基因表達(dá)時(shí)被發(fā)現(xiàn)[1]，在脂肪組織中高表達(dá)，在促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂滴融合和抑制脂肪分解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-4]。鼠敲除Fsp27基因后脂肪水解速率顯著升高，脂肪細(xì)胞中的大脂滴轉(zhuǎn)變成為很多分散均勻的小脂滴[5]。本課題組前期對(duì)不同尾脂沉積能力綿羊品種Fsp27基因序列突變情況進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在該基因5'UTR區(qū)、CDS區(qū)和3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量的SNP位點(diǎn)。初步分析結(jié)果表明，部分位點(diǎn)在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的分布具有明顯的差異性。前期研究結(jié)果表明，在上述SNP位點(diǎn)中5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變?cè)诓煌仓练e能力綿羊品種群體中的分布差異顯著，可能與綿羊的尾脂沉積能力具有相關(guān)性。本文將以尾脂沉積能力極強(qiáng)的阿勒泰羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)Fsp27基因5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變與阿勒泰羊尾脂沉積能力關(guān)聯(lián)性進(jìn)行深入分析，以期為進(jìn)一步闡明Fsp27基因在阿勒泰羊優(yōu)良尾脂性狀形成中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及脂尾體積測(cè)量

本試驗(yàn)所用250份阿勒泰羊耳組織采自新疆阿勒泰地區(qū)富蘊(yùn)縣阿勒泰羊種群核心群1.5～2歲個(gè)體，每份樣品進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)測(cè)量該樣品對(duì)應(yīng)個(gè)體脂尾的長(zhǎng)、寬和厚，并記錄該阿勒泰羊的性別，以備后期分析。采集的耳組織4 ℃暫時(shí)冷藏保存，并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于提取阿勒泰羊基因組。

1.2 DNA提取

耳組織樣品基因組DNA采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(索萊寶，中國(guó))提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

檢索Ensemble網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/index.html)，獲得綿羊Fsp27基因序列，然后與UCSC中(http://genome.ucsc.edu/)收錄的綿羊基因組序列(Oar_v4.0, Nov. 2015)比對(duì)，截取包含F(xiàn)sp27基因5'UTR區(qū)的序列共計(jì)780 bp設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：TGCCGACGTAAGATGGACTCTG，下游序列：TCTGCGATGGAGATTGGGGATC，Tm值58 ℃，擴(kuò)增片段大小365 bp，g.16767667位點(diǎn)位于擴(kuò)增片段靠近中部位置，以利于后續(xù)進(jìn)行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)檢測(cè)。引物使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及SSCP檢測(cè)

以阿勒泰羊基因組為模板，采用上述引物擴(kuò)增阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR區(qū)，反應(yīng)采用20 μL體系 Premix Taq (TAKARA Taq Version 2.0 plus dye)10 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μM)，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別取2 μLPCR產(chǎn)物與8 μL變性上樣緩沖液混合，置于100 ℃金屬浴上變性10 min，迅速置于冰上降溫冷卻，然后全部上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，先300 V電壓下電泳5 min，然后在120 V下電泳12 h。電泳結(jié)束后將凝膠取下，進(jìn)行銀染，然后置于凝膠成像儀(BIO-RAD)中拍照。

1.5 Fsp27基因突變情況檢測(cè)與其綿羊尾脂沉積能力關(guān)聯(lián)性

選擇SSCP帶型不同的PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，以確定不同基因型與SSCP帶型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后以此對(duì)250份阿勒泰羊基因組進(jìn)行分型。將分型結(jié)果與前期測(cè)量的對(duì)應(yīng)個(gè)體尾型數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，以找出不同基因型與阿勒泰羊脂尾體積數(shù)據(jù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)基因型阿勒泰羊的尾脂沉積能力做出評(píng)估。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0軟件計(jì)算Fsp27基因g.16767667位點(diǎn)SNP的基因型頻率及等位基因頻率，并使用卡方檢驗(yàn)的方法分析群體中基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡。阿勒泰羊尾形數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，多重比較采用最小顯著差數(shù)法(least significant difference, LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的基因組DNA和PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，從電泳圖片可見(jiàn)提取的阿勒泰羊基因組DNA電泳條帶亮度較高，沒(méi)有明顯拖帶(圖1A)，說(shuō)明提取的DNA濃度和質(zhì)量均較高，可以滿足后期PCR擴(kuò)增的要求。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果條帶清晰明亮，沒(méi)有雜帶，條帶大小符合預(yù)期設(shè)計(jì)(圖1B)，說(shuō)明引物的特異性和擴(kuò)增效率均很高，為后期進(jìn)行高質(zhì)量SSCP檢測(cè)提供了保障。

圖1 阿勒泰羊部分基因組DNA(A)和Fsp27基因5'UTR 區(qū)PCR產(chǎn)物檢測(cè)(B)Fig.1 Detection of Altay sheep DNA (A) and PCR production of Fsp27 gene 5'UTR region (B)

2.2 SPSS分型及基因測(cè)序驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測(cè)可見(jiàn)三種不同的帶型(圖2A)，挑選不同帶型對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，可知三種帶型分別對(duì)應(yīng)GG、AG和AA三種基因型(圖2B)。所以，F(xiàn)sp27基因5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變?cè)诎⒗仗┭蛉后w中三種基因型均可以檢測(cè)到。

圖2 SSCP檢測(cè)結(jié)果(A)及相應(yīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig.2 Result of SSCP detection (A) and sequencing data of corresponding PCR production (B)

2.3 不同基因型在阿勒泰羊群體中分布及與尾型數(shù)據(jù)的對(duì)應(yīng)性分析

通過(guò)250份阿勒泰羊基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)sp27基因5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變產(chǎn)生的三種基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群體中的分布存在明顯的差異。GG基因型個(gè)體占樣本總量的47.2%，AG基因型占38.4%，而AA基因型僅占14.4%，在檢測(cè)的阿勒泰羊群體中G等位基因頻率達(dá)66.4%，為優(yōu)勢(shì)等位基因?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在阿勒泰羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說(shuō)明該位點(diǎn)在阿勒泰羊品種群體中處于遺傳平衡狀態(tài)，同時(shí)也可推測(cè)在阿勒泰羊的培育過(guò)程中該位點(diǎn)可能沒(méi)有受到選擇、遷移和遺傳漂變等的影響。

表1 g.16767667位點(diǎn)G>A突變基因頻率和基因型頻率在阿勒泰羊群體中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)Table 1 Genotypes and allele frequencies distributions of g. 16767667 locus G>A SNP in Altay sheep population and Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium

為了進(jìn)一步分析g.16767667位點(diǎn)G>A突變不同基因型對(duì)阿勒泰羊尾脂沉積能力的影響，將不同基因型阿勒泰羊個(gè)體的尾形數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比分析(表2)。結(jié)果表明，不論是公羊還是母羊，GG和AG基因型個(gè)體脂尾(臀)的長(zhǎng)、寬和厚3項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯著高于AA基因型個(gè)體(P<0.05)，GG基因型個(gè)體亦略高于AG基因型個(gè)體，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 阿勒泰羊不同基因型個(gè)體尾形數(shù)據(jù)對(duì)比分析Table 2 Data comparison of fat tail size of Altay sheep with different genotype

3 討 論

有關(guān)綿羊SNP位點(diǎn)與脂肪沉積能力的關(guān)聯(lián)性已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本課題組前期在綿羊7號(hào)染色體和X染色體上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與綿羊尾脂沉積能力相關(guān)的SNP位點(diǎn)[6-9]，2012年伊朗學(xué)者M(jìn)oradi等使用高密度SNP芯片對(duì)產(chǎn)于伊朗的脂尾和瘦尾綿羊品種進(jìn)行全基因組精細(xì)掃描，亦檢測(cè)到大量與綿羊尾脂沉積能力相關(guān)的SNP位點(diǎn)[10]。本研究證實(shí)阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變產(chǎn)生的三種基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群體中的分布存在明顯的差異，且與阿勒泰羊的尾形存在關(guān)聯(lián)性，GG和AG基因型的個(gè)體，脂尾(臀)的長(zhǎng)、寬和厚三項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯著高于AA基因型的個(gè)體(P<0.05)。這些SNP位點(diǎn)均與綿羊的尾脂沉積能力高度相關(guān)，所以可以作為很好的分子標(biāo)記應(yīng)用于低脂肪綿羊品種的選育。但是，這些SNP位點(diǎn)是否直接參與脂肪沉積，以及參與的途徑仍需后續(xù)開(kāi)展深入的研究。

Fsp27基因在動(dòng)物體脂肪代謝過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用，已得到相關(guān)文獻(xiàn)的證實(shí)。Fsp27定位在脂肪細(xì)胞脂滴和的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面[11-12]，通過(guò)促進(jìn)小脂滴相互融合為大脂滴[3,13]，以及特異性抑制激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)在脂滴表面的定位，進(jìn)而抑制其對(duì)脂肪的水解作用[4]，最終達(dá)到促進(jìn)脂肪沉積，抑制脂肪分解的作用。Fsp27的半衰期很短，所以，機(jī)體通過(guò)調(diào)控Fsp27的表達(dá)水平可以快速響應(yīng)體內(nèi)脂肪酸的水平，進(jìn)而保障了機(jī)體內(nèi)脂肪的沉積和分解活動(dòng)與機(jī)體的能量供應(yīng)相適應(yīng)[11]。本研究涉及的g.16767667位點(diǎn)G>A突變處于Fsp27基因5'UTR區(qū)，由于mRNA的5'UTR區(qū)與翻譯起始調(diào)控、穩(wěn)定性、剪切加工及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位等過(guò)程密切相關(guān)[21]，所以5'UTR區(qū)的基因突變很可能會(huì)影響上述生物學(xué)過(guò)程的正常進(jìn)行，進(jìn)而可能影響Fsp27基因mRNA的翻譯及其蛋白水平，并最終影響其生物學(xué)功能。本研究中GG和AG基因型個(gè)體尾形數(shù)據(jù)均顯著高于AA基因型的個(gè)體(P<0.05)，有可能與GG和AG基因型有利于Fsp27基因mRNA的翻譯，提高其蛋白水平，進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂肪的沉積有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

阿勒泰羊的形成具有特定的人文和生態(tài)環(huán)境背景。阿勒泰羊主要生活在我國(guó)新疆北部的阿勒泰地區(qū)，當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的一個(gè)顯著特點(diǎn)是夏秋季節(jié)氣候涼爽、牧草豐茂，但是冬季枯草期漫長(zhǎng)而寒冷。所以，生活在這里的野生草食動(dòng)物或者純放牧狀態(tài)的草食家畜必須具備在短期內(nèi)迅速在體內(nèi)蓄積足夠脂肪的能力，否則無(wú)法順利越冬。另外，阿勒泰地區(qū)主要生活的是哈薩克族牧民，常年以放牧為生，在寒冷的冬季亦需要攝入大量的肉和脂肪來(lái)滿足機(jī)體的能量供應(yīng)，抵御當(dāng)?shù)氐暮涮鞖?，所以歷代牧民加強(qiáng)了儲(chǔ)脂能力強(qiáng)的綿羊品種的選育。在這種自然和人為的雙重選育下才培育出了具有優(yōu)良脂尾(臀)的阿勒泰羊。但是，近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)高脂肪肉食品攝入引起的心腦血管疾病發(fā)病率升高日益關(guān)注，市場(chǎng)對(duì)低脂肪羊肉的需求量日益增大[15]。另外，隨著草場(chǎng)保護(hù)政策的推進(jìn)，以及舍飼養(yǎng)羊的逐漸普及和圈舍、飼草條件的改善，阿勒泰羊尾部脂肪的保命作用已沒(méi)有太多實(shí)際的價(jià)值。所以，該品種存在進(jìn)一步選育提高，在保留其優(yōu)良性狀的前提下逐步提高其胴體的瘦肉率的迫切需要。因而需要闡明其尾部脂肪沉積相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，用于指導(dǎo)育種實(shí)踐，提高育種效率。就此而言，圍繞阿勒泰羊尾脂沉積開(kāi)展相關(guān)功能基因研究又具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)Fsp27基因5'UTR區(qū)g.16767667位點(diǎn)G>A突變?cè)诎⒗仗┭蛉后w中的分布以及與阿勒泰羊尾脂沉積能力進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)GG和AG基因型在群體中的比重較大，且其尾形數(shù)據(jù)也顯著高于AA基因型個(gè)體，推測(cè)G等位基因有利于阿勒泰羊尾脂沉積。上述結(jié)果將為進(jìn)一步闡明阿勒泰羊優(yōu)良脂尾(臀)性狀的形成機(jī)制以及低脂肪綿羊品種的培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。