李玉華 姜楠 李景清 安文源

【摘 要】 目的：建立HPLC法測(cè)定蒙成藥薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A的含量。方法：采用InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為用三乙胺調(diào)至pH（6.0±0.1）的甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：羥基紅花黃色素A在0.03006～1.2024 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r=0.9999;平均回收率97.38% （RSD=0.88%）。結(jié)論：所建立的HPLC法穩(wěn)定可靠，可作為薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定的方法。

【關(guān)鍵詞】 薩仁-嘎日迪;羥基紅花黃色素A;HPLC;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2021）22-0047-04

Determination of? Hydroxysafflor Yellow A in Mongolian Saren-Gridi by HPLC

LI Yuhua JIANG Nan LI Jingqing AN Wenyuan

Tongliao Institute for Food and Drug Control， Tongliao 028000，China

Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） for determination of Hydroxysafflor yellow A in Mongolian Saren-Gridi. Methods? The HPLC was carried out with InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， Using methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid solution （19.5∶1.5∶79）as mobile phase（PH（6.0±0.1）adjusted by triethylamine）at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The wavelength was set at 403 nm，the column temperature was 40℃，and the injection volume was 10 μL.Results The linear of? hydroxysafflor yellow A was in the range of 0.03006 μg～1.2024 μg （r=0.9999）.The average recovery was 97.38% （RSD=0.88%）.Conclusion This method is simple， high accuracy and specificity. It can be used for the determination of? hydroxysafflor yellow A.

Keywords：Saren-Gridi; Hydroxysafflor Yellow A;HPLC ;Content Determination

薩仁-嘎日迪由紅花、黑云香、草烏、訶子、丁香、水銀（制）、石菖蒲、木香、硫黃、白硇砂、苘麻子、白云香（楓香脂）、草決明、蘇格木勒、草果仁、海金沙、方海、石膏、肉豆蔻、人工麝香、人工牛黃等二十一味藥組成。具有消“粘”腫，燥“協(xié)日烏素”，祛“亞瑪”等功效，用于治療半身不遂，左癱右瘓，風(fēng)濕骨痛，白喉，瘡瘍膿腫，鼻炎，偏頭痛等癥[1-2]。方中主藥紅花，性溫，味辛，具有散瘀止痛、活血通經(jīng)、抗腫瘤、抗菌、抗疲勞等多種生理活性[3-5]。作為臨床常用的蒙藥醫(yī)院制劑，薩仁-嘎日迪療效確切，未見(jiàn)任何不良反應(yīng)發(fā)生。但目前為止，該成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還停留在1984年版《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》階段，只有簡(jiǎn)單的外觀性狀和檢查項(xiàng)目[6]。以紅花中主要活性成份羥基紅花黃色素A為指標(biāo)，建立薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定的方法，能有效控制該成藥的內(nèi)在質(zhì)量，為該成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（四元梯度泵，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站），Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，LabSolution工作站），92SM-202A型電子天平，XS3DU電子天平，KQ5200DE超聲波清洗機(jī)。

1.2 試藥 對(duì)照品羥基紅花黃色素A（批號(hào)：110637-201810，含量93.1%）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;水為高純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。4批薩仁-嘎日迪醫(yī)院制劑來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7-9] InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為用三乙胺調(diào)至pH*6.0±0.1）的甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。記錄時(shí)間20 min，理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算，應(yīng)不低于4000。

2.2 對(duì)照品、供試品溶液及陰性對(duì)照品的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品7.514 mg，置50 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1503 mg/mL的羥基紅花黃色素A對(duì)照品貯備液。精密吸取該對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得羥基紅花黃色素A（30.06 μg/mL）對(duì)照品溶液。

取樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)后作為供試品溶液。

取處方中除紅花以外的二十味藥材，粉碎成細(xì)粉，按處方比例稱重，其中人工麝香、人工牛黃需與其它藥材細(xì)粉配研，所有藥材粉末混合均勻，過(guò)篩，涼開(kāi)水泛丸，銀朱包衣，打光，干燥，即得陰性對(duì)照品。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取按處方比例制備的不含紅花藥材的陰性對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對(duì)照品以及供試品色譜圖相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性強(qiáng)，其他組分對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下羥基紅花黃色素A對(duì)照品貯備液（0.1503mg/mL）200、1000、2000、4000、6000、8000 μL，置于10 mL量瓶中，用25%甲醇稀釋定容后得到3.006、15.03、30.06、60.12、90.18、120.24 μg/mL系列濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取上述各梯度濃度的對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對(duì)照品的量X為橫坐標(biāo)，得到羥基紅花黃色素A回歸方程為：Y=34186X，r=0.9999。表明羥基紅花黃色素A在0.03006～1.2024 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品2.0115 g，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備法配制成精密度試驗(yàn)溶液，精密吸取該溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積的RSD值為0.64%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品2.0053 g，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，精密吸取該溶液10 μL，分別于0、2、4、6、12、24 h注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)峰面積的RSD值為0.93%，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品6 份，每份約2.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果6份平行樣含量平均值為0.3711 mg/g，RSD為1.15%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已測(cè)得含量的樣品（扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128，含量為0.3711 mg/g）9份，每份約1.0g，每三份一組，精密稱定，置具塞錐形瓶中，再精密加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品貯備液（0.1503 mg/mL）1250、2500、3750 μL，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，配制成高、中、低3個(gè)濃度的加標(biāo)回收溶液，精密量取各加標(biāo)回收溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。3個(gè)濃度加標(biāo)回收率平均值為97.38%，RSD值為0.88%。

2.9 色譜柱、儀器設(shè)備的耐用性試驗(yàn) 換不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱及不同的液相色譜儀，取扎魯特旗蒙醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190128的2號(hào)樣品，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取該樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A含量。結(jié)果見(jiàn)表3。從表中數(shù)據(jù)可以看出，羥基紅花黃色素A含量變化不大（RSD為1.05 %），表明該方法對(duì)不同色譜柱和儀器設(shè)備耐用性良好。

2.10 樣品含量測(cè)定[10] 分取4個(gè)廠家提供的薩仁-嘎日迪樣品粉末約2.0g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取各樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4數(shù)據(jù)可以看出：不同醫(yī)院制劑室提供的4批成藥中，羥基紅花黃色素 A 的含量存在著明顯的差異。考慮到所用的紅花藥材之間的含量差異，同時(shí)對(duì)各批成藥相對(duì)應(yīng)的紅花原藥材的含量進(jìn)行了測(cè)定，計(jì)算出各批成藥中羥基紅花黃色素A的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5中數(shù)據(jù)顯示，不同制劑室生產(chǎn)的4批成藥中，薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A的平均轉(zhuǎn)移率在75.5%～100.0%之間。參考《中國(guó)藥典》2015 年版一部“紅花”含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定含羥基紅花黃色素 A 量不得少于 1.0%[8]，結(jié)合各批成藥的平均轉(zhuǎn)移率，暫定本品每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A（C27H32O16）計(jì)，不得少于0.33 mg。

3 討論

參照《中國(guó)藥典》2015[6]年版一部“紅花”含量測(cè)定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測(cè)定方法[8]，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26∶2∶72）為流動(dòng)相，結(jié)果目標(biāo)峰羥基紅花黃色素A拖尾因子1.49，拖尾嚴(yán)重，調(diào)整流動(dòng)相比例甲醇-乙腈-0.7%磷酸（19.5∶1.5∶79），并用三乙胺調(diào)至pH（6.0±0.1），此時(shí)目標(biāo)峰羥基紅花黃色素A拖尾因子1.102，與其它干擾組分分離較好，保留時(shí)間適宜，理論塔板數(shù)較高。故作為檢測(cè)流動(dòng)相。

成藥粉末以25%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提?。üβ?20 W，頻率40 kHz），為保證被測(cè)成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取40、50、60 min不同超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果羥基紅花黃色素A的含量基本一致（RSD 0.51%），故提取時(shí)間定為40 min。

通過(guò)專屬性，精密度，穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)，色譜柱及不同儀器設(shè)備的耐用性考察，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，可作為薩仁-嘎日迪中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定的方法。

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（收稿日期：2021-04-06 編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（2019-MB022）。

作者簡(jiǎn)介：李玉華（1971-），女，蒙古族，碩士，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)。E-mail：ambaby@vip.163.com