李全有 劉海軍

【摘 要】 目的：探究豬苓多糖對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠炎癥因子的影響。方法：雄性SD大鼠，腹腔注射LPS（5 mg/kg）構(gòu)建急性肺損傷模型，用豬苓多糖（250 mg/kg）灌胃進(jìn)行處理。計算肺組織濕干重比，HE染色檢測肺組織病理學(xué)變化，ELISA檢測血清中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-α、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和白介素-1β的水平，肺組織中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、髓過氧化物酶（MPO） 和超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)水平。結(jié)果：Model組肺組織損傷嚴(yán)重，而豬苓多糖治療能夠有一定程度緩解肺損傷;與Control組相比，Model組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)，以及MDA和MPO表達(dá)水平升高，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與Model組相比，豬苓多糖組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)水平，以及MDA和MPO表達(dá)水平有所降低，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：豬苓多糖可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 豬苓多糖;急性肺損傷模型大鼠;TGF-α;IL-1β;IL-18

【中圖分類號】R563.9?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）22-0021-04

Effects of Polyporus Umbellatus Polysaccharide on Inflammatory Factors in Rats with LPS-induced Acute Lung Injury

LI Quanyou LIU Haijun

Department of pharmacy， Anyang Hospital of traditional Chinese medicine，Henan Province，Anyang 455000，China

Abstract：Objective To explore the effects of Polyporus umbellatus polysaccharide on inflammatory factors in rats with acute lung injury induced by LPS. Methods Male SD rats were purchased， LPS （5 mg/kg） was injected intraperitoneally to construct an acute lung injury model， and polyporus polysaccharide （250 mg/kg） was administered by gavage. Calculate the wet-to-dry weight ratio of lung tissue， HE staining to detect lung tissue pathological changes， ELISA to detect transforming growth factor（TGF）-α， interleukin-6（IL-6）， interleukin-10（IL-10） and interleukin- 1β level， the expression level of malondialdehyde（MDA）， glutathione peroxidase（GSH-Px）， myeloperoxidase （MPO） and superoxide dismutase （SOD） in lung tissue.Results The lung tissue damage in the Model group was severe， and Polyporus umbellatus polysaccharide treatment could relieve the lung damage to a certain extent; compared with the Control group， the lung tissue wet-to-dry weight ratio， TGF-α， IL-18， IL-6 and IL in the Model group -1β expression， as well as the expression levels of MDA and MPO increased， while the expression levels of GSH-Px and SOD were significantly reduced（P<0.05）; compared with the Model group， the lung tissue wet-to-dry weight ratio of the polyporus polysaccharide group， TGF-α， The expression levels of IL-18， IL-6 and IL-1β， as well as the expression levels of MDA and MPO decreased， while the expression levels of GSH-Px and SOD increased （P<0.05）.Conclusion Polyporus umbellatus polysaccharide can alleviate the inflammatory response in rats with acute lung injury induced by LPS.

Keywords：Polyporus Umbellatus Polysaccharide;Acute Lung Lnjury Model Rat; TGF-α; IL-1β; IL-18

急性肺損傷（Acute lung injuny，ALI）是一種具有高發(fā)病率和死亡率的炎性疾病[1]。ALI或更嚴(yán)重的形式是急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS），其特征是嚴(yán)重的肺水腫，肺炎細(xì)胞聚集和炎性細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致強(qiáng)烈的肺部炎癥反應(yīng)[2]。流行病學(xué)研究報告[3]指出，ALI仍然是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，也是臨床醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)[3]。盡管已采取一些治療策略來改善功能結(jié)局，但ALI患者的死亡率仍然很高，故需要研究ALI的潛在機(jī)制和新的治療方法。豬苓多糖是由中藥豬苓提取的多糖類物質(zhì)，能夠提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能[4]，豬苓多糖膠囊和注射劑均已獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)，已在中國單獨或與多種臨床藥物聯(lián)合使用來治療乙型肝炎，肺癌和肝癌等疾病[5]。在肺部疾病中，豬苓多糖可以通過抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖和遷移而發(fā)揮有效的抗纖維化作用[6]，說明了在肺部疾病中豬苓多糖可以發(fā)揮調(diào)控作用，但是在ALI中尚未有相關(guān)研究，本項目的開展可能為ALI的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠（182～218 g），18只，購自上海Slaccas實驗動物有限公司，并以12 h光照/黑暗周期飼養(yǎng)在SPF實驗動物室中，實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。[JP]

1.2 藥物和試劑 豬苓多糖（國藥準(zhǔn)字Z10970134，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司），按劑量溶于生理鹽水;脂多糖（LPS）（北京索萊寶科技有限公司），酶聯(lián)免疫吸附法ELISA試劑盒（abcam）。

1.3 動物分組和模型制備 將18只大鼠隨機(jī)分為三組，每組各6只：Control組，生理鹽水灌胃，腹腔注射生理鹽水;Model組，生理鹽水灌胃，腹腔注射LPS（5 mg/kg）;豬苓多糖組，豬苓多糖（250 mg/kg）灌胃，腹腔注射LPS（5 mg/kg）。每天灌胃一次，連續(xù)5 d，之后用腹腔注射LPS（5 mg/kg）建模。建模成功后6 h，麻醉斷頭處死，取出左肺組織稱濕重（W） ，于110 ℃烘烤24 h，稱重即為干重（D） ，計算肺組織濕干重比：W/D= W（mg） /D（mg） 。收集血清以及右肺組織進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4 HE染色 提取肺組織，在緩沖液中保持48 h，之后進(jìn)行脫水、浸蠟等操作，進(jìn)行HE染色，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.5 血清炎癥因子水平檢測 收集血液，4 ℃離心分離血清，分離后的血清放置在-80 ℃保存。使用ELISA試劑盒檢測血清中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-α、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和白介素-1β的水平。

1.6 氧化自由基相關(guān)指標(biāo)檢測 根據(jù)ELISA試劑盒說明，檢測肺組織中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、髓過氧化物酶（MPO） 和超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0版本用于統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，服從正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 如圖1顯示，Control組肺泡未見出血和水腫，細(xì)胞浸潤結(jié)構(gòu)清晰;Model組炎性細(xì)胞出現(xiàn)浸潤，肺泡損傷明顯，肺泡、肺間質(zhì)和肺毛細(xì)血管發(fā)生水腫，肺泡壁增厚;豬苓多糖組水腫程度改善，損傷程度有一定減輕，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤。

2.2 肺組織濕干重比 如表1所示，與Control組肺組織濕干重比相比，Model組肺組織濕干重比升高（P<0.05），與Model組肺組織濕干重比相比，豬苓多糖組肺組織濕干重比降低（P<0.05），說明豬苓多糖的治療能夠降低LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠肺組織濕干重比。

2.3 各組炎癥因子水平比較 如表2所示，與Control組相比，Model組TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)明顯升高，而與Model組相比，豬苓多糖組TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)水平有所降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 氧化自由基相關(guān)指標(biāo)檢測 如表3所示，與Control組相比，Model組MDA和MPO表達(dá)水平升高，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平明顯降低，而與Model組相比，豬苓多糖組MDA和MPO表達(dá)水平有所降低，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

ALI是一種進(jìn)展性綜合征，其發(fā)病率和死亡率較高[7]。 ALI的生理特征是肺泡-毛細(xì)血管膜屏障的破壞，導(dǎo)致跨上皮炎性細(xì)胞的遷移和促炎性細(xì)胞因子的釋放顯著增加[8]。肺內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞均會發(fā)生損傷，導(dǎo)致肺功能喪失[9]。其特征在于促炎性介質(zhì)的過度產(chǎn)生，炎性細(xì)胞的浸潤以及肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，因此抑制失控的炎癥反應(yīng)可能是治療ALI的關(guān)鍵。豬苓的使用在中國已經(jīng)有2000多年的歷史，豬苓多糖是豬苓的主要成分，研究[10]表明，豬苓多糖可以通過調(diào)控有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）減輕LPS刺激的J774細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在巨噬細(xì)胞免疫調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，豬苓多糖可以抑制M2巨噬細(xì)胞的黏附和偽足生成，能夠激活TLR2/TLR4-NF-κB信號通路，顯著增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力[11]，說明了豬苓多糖能夠參與疾病炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，已被廣泛用于通過氣管內(nèi)插管法誘導(dǎo)ALI的動物模型。與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合后，LPS誘導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)通路的激活，這些信號通路負(fù)責(zé)向肺內(nèi)注入炎癥性細(xì)胞（即嗜中性白細(xì)胞）并產(chǎn)生炎癥原性細(xì)胞因子[12]。LPS與TLR4的結(jié)合還誘導(dǎo)IκB-α磷酸化和降解，促進(jìn)核易位和NF-κB活化，并隨后導(dǎo)致過度釋放促炎性細(xì)胞因子，例如，腫瘤壞死因子-α （TNF-α），白介素（IL）-1β，IL-6] [13]。此外，LPS可以激活MAPK家族成員JNK，活化的JNK可以磷酸化許多線粒體蛋白，包括Bcl-2和Bcl-xl [14]。

研究通過LPS構(gòu)建急性肺損傷模型大鼠進(jìn)行實驗操作，用豬苓多糖處理急性肺損傷模型大鼠，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Model組肺組織損傷嚴(yán)重，而豬苓多糖治療能夠有一定程度緩解肺損傷;與Control組相比，Model組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)，以及MDA和MPO表達(dá)水平升高，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平明顯降低;與Model組相比，豬苓多糖組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達(dá)水平，以及MDA和MPO表達(dá)水平有所降低，而GSH-Px和SOD表達(dá)水平升高。說明了豬苓多糖可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型大鼠炎癥反應(yīng)，對于急性肺損傷的治療研究有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]羅亞嵐，許才明，李兆霞，等.NLRP3炎性小體——急性肺損傷的發(fā)病核心[J].中國急救醫(yī)學(xué)，2019，39（3）：285-289.

[2]由淑萍，汪波，趙軍，等.肉蓯蓉苯乙醇總苷對脂多糖致大鼠急性肺損傷的抑制作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2019，33（5）：347-353.

[3]陳艷，董良，朱昭瓊.急性肺損傷治療措施的研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志，2020，40（1）：157-161.

[4]黃青，李麗媛，劉晴晴，等.靈芝多糖和豬苓多糖及其復(fù)方的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2020，41（17）：275-282.

[5]李明祥，俞維英.豬苓多糖對Lewis肺癌荷瘤小鼠抑瘤作用及外周血細(xì)胞的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2018，25（5）：653-655.

[6]JIANG J，WANG F，LUO A，et al.Polyporus Polysaccharide Ameliorates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis by Suppressing Myofibroblast Differentiation via TGF-β/Smad2/3 Pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020，11（5）：767.

[7]楊琦，曾迎楠，許永安.急性肺損傷發(fā)病與發(fā)展相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展[J].國際呼吸雜志，2020，40（24）：1904-1909.

[8]韓鳳. 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷與急性呼吸窘迫綜合征[J]. 中國急救醫(yī)學(xué)， 2015（35）：1053.

[9]金善子， 胡博， 欒正剛. 高遷移率族蛋白1在膿毒癥急性肺損傷中作用的研究進(jìn)展[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2018（4）：459-462.

[10]江澤波， 李思明， 趙晉，等. 豬苓多糖對LPS誘導(dǎo)的J774炎癥模型的抗炎作用及其機(jī)制[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2015， 21（3）：156-159.

[11]譚慶龍， 周昌園， 劉春萍，等. 豬苓多糖對人巨噬細(xì)胞形態(tài)及免疫功能的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2018， 33（5）：215-220.

[12]WU X，KONG Q，ZHAN L，et al.TIPE2 ameliorates lipopolysaccharide-induced apoptosis and inflammation in acute lung injury[J]. Inflammation Research，2019，68（11）：981-992.

[13]禚志紅， 張靜， 李國棟，等. 腹腔注射脂多糖對幼鼠癲癇發(fā)作及海馬TLR4/HMGB1/P-IκB-α表達(dá)的影響[J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志， 2018（2）：117-123.

[14]覃蘭惠. 在脂多糖誘導(dǎo)的血腦屏障破壞中p38MAPK、JNK信號通路與基質(zhì)金屬蛋白酶作用機(jī)制的研究[D]. 南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2015.

（收稿日期：2021-04-02 編輯：劉 斌）