何夢(mèng)喬 許妍 荊鳳娟 閆雪蓮 焦雪 姜馨曄

摘要：目的 將鈦微弧氧化涂層鈦片置于不同濃度的殼聚糖溶液中浸泡，對(duì)其進(jìn)行成骨細(xì)胞生物相容性檢測(cè)，評(píng)價(jià)其生物相容性。

關(guān)鍵詞：純鈦;MC3T3-E1細(xì)胞;殼聚糖;抗菌性;生物相容性

【中圖分類號(hào)】R4 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）14--01

引言

正畸治療過程中常常會(huì)遇到一些疑難病例，比如骨性上頜前突、磨牙高位等，這些復(fù)雜的病例往往不能通過普通的托槽矯治解決，這時(shí)正畸支抗釘進(jìn)入應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)現(xiàn)有的正畸支抗釘材料進(jìn)行表面處理，觀察其是否擁有更加優(yōu)良的細(xì)胞相容性抗菌性能。以純鈦和鈦合金材料制作的醫(yī)療器械已經(jīng)廣泛應(yīng)用于口腔種植、骨折固定、美容植入等領(lǐng)域，隨著對(duì)口腔植入物表面改性技術(shù)的深入發(fā)展，一些有機(jī)材料如殼聚糖，海藻酸鈉等有機(jī)質(zhì)開始成為骨修復(fù)材料應(yīng)用于臨床之中?？谇辉谌梭w中是一個(gè)特殊的復(fù)雜成分聚集體。唾液、食物、菌斑，細(xì)菌以及其代謝產(chǎn)物的長(zhǎng)期混合使得口腔植入物受到感染的風(fēng)險(xiǎn)急劇增大。鈦金屬本身具有生物惰性，不具備抗菌性，支抗釘周圍組織感染是支抗釘手術(shù)后失敗的主要原因。如何在保持鈦支抗釘微弧氧化表面的高生物活性的同時(shí)增強(qiáng)其抗菌性，降低感染風(fēng)險(xiǎn)是當(dāng)今研究的發(fā)展方向。

1.材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：純鈦微弧氧化鈦片150枚φ=10mm，厚1mm。對(duì)照A 組：純鈦微弧氧化鈦片50枚。實(shí)驗(yàn)B組：純鈦微弧氧化-殼聚糖低濃度（1.5g/L）浸泡處理鈦片50枚。實(shí)驗(yàn)C組：純鈦微弧氧化-殼聚糖高濃度（3g/L）浸泡處理鈦片50枚。所有鈦片都經(jīng)酒精浸泡過夜后紫外線照射30min，每面重復(fù)照射3次。

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

MC3T3-E1（小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克?。┘?xì)胞購，將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中升溫，2分鐘后取出不斷搖動(dòng)使其融化。75%乙醇溶液消毒管外壁，置于超凈臺(tái)中。吸出細(xì)胞懸液加入5ml培養(yǎng)液，1000r/min離心5min，棄上清。加入培養(yǎng)液吹打混勻，置于培養(yǎng)箱里中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，傳代培養(yǎng)，備用。

1.2細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞鋪滿70%～80%瓶底，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將A、B組試件鋪在24孔板內(nèi)，每種處理方式3個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞數(shù)為2×104/孔，分別培養(yǎng)30min、60min、90min、120min，棄去上清液，PBS沖洗3次，加入無血清的培養(yǎng)基和CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4h，吸取上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值，求平均值并繪制三線表。

1.3細(xì)胞增殖性實(shí)驗(yàn)

用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，將A、B組試件鋪在24孔板內(nèi)，每種處理方式3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞數(shù)為5×103/孔，分別培養(yǎng)2、4、6天，棄去上清液，PBS沖洗3次，加入無血清的培養(yǎng)基和CCK-8試劑，繼續(xù)孵育3h，避光條件下吸取上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，求平均值并繪制柱狀圖。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，P <0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1CCK-8黏附性實(shí)驗(yàn)

如表1所示，應(yīng)用spss20.0進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析：不同處理組之間的差異，F(xiàn)=82.170，P=0.000<0.05，不同時(shí)間點(diǎn)的差異，F(xiàn)=495.555，P=0.000<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)30min、60min、90min、120min時(shí)B、C組黏附的細(xì)胞密度顯著高于A組。且各時(shí)間點(diǎn)B、C組生長(zhǎng)吸光度值均>A組，說明B、C組黏附情況優(yōu)于A組。

2.2CCK-8增殖性實(shí)驗(yàn)

如表2所示，采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)總體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體方法用重復(fù)測(cè)量的方差分析，不同處理組組間采用LSD的兩兩比較。數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。三組細(xì)胞數(shù)量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，不同處理組之間的差異，F(xiàn)=133.168，P=0.000<0.05，不同時(shí)間點(diǎn)的差異，F(xiàn)=364.946，P=0.000<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組試件表面細(xì)胞吸光度值顯著大于A、B兩組，說明C組試件表面細(xì)胞增殖狀況最佳。

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)總體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體方法用重復(fù)測(cè)量的方差分析，不同處理組組間采用LSD的兩兩比較。不同處理組之間的差異F=101.806，P=0.000<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同時(shí)間點(diǎn)的差異，F(xiàn)=607.654，P=0.000<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組試件表面成骨細(xì)胞活性均隨著時(shí)間增大，第3、5天，C組成骨細(xì)胞ALP活性優(yōu)于AB兩組，顯示高濃度殼聚糖涂層有利于細(xì)胞分化。

3討論

在黏附實(shí)驗(yàn)中B、C兩組在吸光度數(shù)值上差別不甚顯著。實(shí)驗(yàn)中B、C兩組試件表面的黏附率均大于單純的微弧氧化表層。細(xì)胞的增殖能力能夠反應(yīng)出細(xì)胞的整體生物功能特性，在增殖實(shí)驗(yàn)中，C組的試件表面增殖率顯著高于B、A兩組，堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)中，C組堿性磷酸酶活性顯著高于B、A兩組，說明在細(xì)胞增殖過程中高濃度組細(xì)胞生命活動(dòng)的細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)更強(qiáng)。

殼聚糖等多糖基物質(zhì)可預(yù)防疾病的發(fā)生，抑制多種細(xì)菌的聚集;殼聚糖本身能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和黏附，還具有良好的抑菌作用，也可在多糖材料特定效能的協(xié)助下持久有效發(fā)揮黏結(jié)、抗菌、再生等效果。此外，多糖也可在體內(nèi)酶解產(chǎn)生單糖，作為細(xì)胞生長(zhǎng)的能源物質(zhì)利于組織修復(fù)。殼聚糖作為多糖材料中一種較為重要的物質(zhì)，因其分子中帶有游離氨基，這些氨基通過結(jié)合負(fù)電子來抑制細(xì)菌：殼聚糖的多聚陽離子易與真菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的基團(tuán)作用，從而改變病原菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性;干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄;阻斷病原菌代謝。殼聚糖作為一種多糖類也具備較高的生物相容性與良好的生物降解速率。殼聚糖作為細(xì)胞外基質(zhì)分泌的誘導(dǎo)劑能使軟骨細(xì)胞易于黏附在殼聚糖表面，相比與其他多糖化合物而言殼聚糖則是甲殼素脫乙酰之后的物質(zhì)，它的特殊性在于其分子鏈帶有正電荷從而使得殼聚糖成為自然界中獨(dú)一無二的具有活性氨基（-NH2）的聚陽離子弱堿性多糖，因此也這使得該材料易于結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁并附著于 DNA，從而抑制細(xì)菌的復(fù)制。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明：3組材料均具有良好的生物相容性，其中純鈦微弧氧化-高濃度殼聚糖浸泡處理的涂層對(duì)于細(xì)胞的黏附、增殖以及堿性磷酸酶表達(dá)均有顯著的促進(jìn)作用，說明殼聚糖浸泡有利于植入的鈦支抗材料的初期穩(wěn)定性以及早期礦化，是一種理想的植入物儲(chǔ)存材料。

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