阮 鳴，喻 斌，周 峰

異黃芪甲苷體外對淋巴細胞和樹突狀細胞免疫功能的影響

阮 鳴1，喻 斌2，周 峰1

1. 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

研究異黃芪甲苷（6--β--葡萄糖基-環(huán)黃芪醇）對體外淋巴細胞和樹突狀細胞功能的影響。培養(yǎng)巨噬細胞，觀察異黃芪甲苷對細胞吞噬中性紅能力和白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-2、IL-6分泌功能的影響。MTT法檢測異黃芪甲苷對原代培養(yǎng)脾淋巴細胞增殖的影響，并用流式細胞術(shù)通過檢測CD3、CD19水平，明確異黃芪甲苷分別對T、B淋巴細胞增殖的影響。進一步觀察異黃芪甲苷對樹突細胞增殖和分泌IL-6、IL-12 p70能力的影響。異黃芪甲苷低、中、高3個劑量組可升高巨噬細胞的吞噬功能和分泌IL-6的能力，降低CD3+的比例，升高CD19+的比例，糾正T、B淋巴細胞的紊亂。中、高劑量組可顯著升高IL-2水平，增加淋巴細胞的增殖，提高增殖指數(shù)（SI），促進樹突狀細胞（dendritic cells，DC）分泌IL-6和IL-12 p70。高劑量組還可升高巨噬細胞分泌IL-1的能力。異黃芪甲苷的免疫促進作用機制與促進非特異性免疫吞噬，促進抗原遞呈、淋巴細胞增殖和樹突細胞分泌能力增強有關(guān)。

異黃芪甲苷；6--β--葡萄糖基-環(huán)黃芪醇；免疫促進；淋巴細胞；樹突細胞

補氣藥黃芪為常用中藥，來源于豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bunge) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bunge的干燥根。該藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有“補氣升陽、益固表衛(wèi)，利水消腫，托瘡生肌”之功效，素有“補藥之長”的美譽?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有多種藥理學(xué)活性，而其對機體免疫功能的促進作用，尤其受到學(xué)者的普遍關(guān)注。已有研究表明黃芪對機體免疫的調(diào)控作用機制涉及促進抗體和免疫因子的生成[1]，此外黃芪多糖和黃芪甲苷被認為是其免疫促進的主要活性成分[2]。

本課題組前期以黃芪藥渣為培養(yǎng)基，選擇靈芝為發(fā)酵菌種，進行雙向固體發(fā)酵，并在發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了6--β--葡萄糖基-環(huán)黃芪醇，進一步證實該化合物是黃芪甲苷的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[3]。6--β--葡萄糖基-環(huán)黃芪醇在結(jié)構(gòu)上是黃芪甲苷脫去1分子木糖形成，為了表示2個化合物的區(qū)別和聯(lián)系，將6--β--葡萄糖基-環(huán)黃芪醇命名為異黃芪甲苷（圖1）。該化合物國內(nèi)暫無其他報道，但國外學(xué)者在其他品種黃芪中已分離獲得[4]，并通過免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)異黃芪甲苷在促進白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-1β和IL-8分泌方面優(yōu)于黃芪甲苷[5]，但至今未見該成分對其他免疫學(xué)指標影響的報道。鑒于此，為了更全面地了解異黃芪甲苷的免疫促進作用，本研究通過整體和離體實驗，進一步深入研究異黃芪甲苷的作用機制。

圖1 異黃芪甲苷化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 動物

ICR健康雄性小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0006。小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物房中，正常飲食。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準（編號201701A006）。

1.2 藥品和試劑

異黃芪甲苷，實驗室制備，質(zhì)量分數(shù)＞98%；環(huán)磷酰胺，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號15102825；無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，美國Hyclone Laboratories公司，批號AB10190291；γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ），北京晶美公司，批號171094；中性紅，北京索萊寶公司，批號506C041；IL-1、IL-2、IL-6 ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；IL-6和IL-12 p70，上海碧云天生物技術(shù)研究所；抗小鼠分化簇19-異硫氰酸熒光素（cluster of differentiation 19-fluorescein isothiocyanate，CD19- FITC）、抗小鼠分化簇3-別藻藍蛋白（cluster of differentiation 3-allophycocyanin，CD3-APC），Biolegend公司；主要組織相容性復(fù)合體II-異硫氰酸熒光素（major histocompatibility complex II- fluorescein isothiocyanate，MHC II-FITC）試劑盒、分化簇11c-藻紅素（cluster of differentiation 11c-phycoerythrin，CD11c-PE）試劑盒，Ebioscience公司。

1.3 儀器

SynergyH1型全功能微孔板檢測儀（酶標儀），美國BIOTEK公司；IX71型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；MCO-5AC型CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司；FC 500MPL型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司；Allegra 64R型冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司。

2 方法

2.1 異黃芪甲苷對巨噬細胞免疫功能的影響

2.1.1 巨噬細胞的制備、分組及給藥 取5只小鼠，ip無血清RPMI 1640培養(yǎng)液2 mL，15 min后頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡15 min，收集腹腔內(nèi)液，1000 r/min離心5 min收集細胞，用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×106/L。取24孔培養(yǎng)板每孔加細胞懸液l mL，置CO2孵箱培養(yǎng)2 h，傾去上清液，用無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液洗去未貼壁細胞，培養(yǎng)孔內(nèi)為巨噬細胞。實驗分5組，即對照組（PBS液）、陽性對照組（1×105U/L IFN-γ）和終濃度為5、10、50 μmol/L的異黃芪甲苷組，各組分別加入1 mL含一系列濃度受試藥物的無酚紅RPMI 1640 10% FBS培養(yǎng)液。

2.1.2 中性紅實驗檢測巨噬細胞吞噬功能 取上述培養(yǎng)24 h的細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入中性紅生理鹽水，使終質(zhì)量濃度為1 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)20 min。PBS洗細胞3次，每孔加入細胞溶解液（乙酸-無水乙醇50∶50）1 mL，室溫放置2 h，待細胞溶解后，吸取上清液0.2 mL于酶標儀上540 nm處測定吸光度（），以該值表示巨噬細胞吞噬功能的強弱。

2.1.3 巨噬細胞產(chǎn)生IL-1、IL-2、IL-6的測定 取上述培養(yǎng)24 h的細胞培養(yǎng)上清液，每組設(shè)6個復(fù)孔，按照IL-1、IL-2、IL-6的ELISA試劑盒說明書進行指標測定。

2.2 異黃芪甲苷對脾淋巴細胞增殖的影響

取“2.1.1”項同一批5只小鼠，用75%乙醇浸泡5 min，無菌操作取脾臟，用完全RPMI 1640培養(yǎng)基制備2.0×106/mL的脾細胞懸液，臺盼藍染料檢測細胞活力＞95%以上。實驗分組同“2.1.1”項，將各組100 μL脾細胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板中，再分別加入刀豆蛋白A（ConA，終質(zhì)量濃度為5 μg/mL）及終濃度為5、10、50 μmol/L的異黃芪甲苷，總體積200 μL。對照組只加200 μL培養(yǎng)基。每組設(shè)6個復(fù)孔。加液后將培養(yǎng)板置于微量振蕩器上振蕩2 min混勻，于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中溫育72 h，然后用MTT法于酶標儀490 nm處測。計算淋巴細胞增殖指數(shù)（SI）。

SI＝異黃芪甲苷/ConA

2.3 異黃芪甲苷對淋巴細胞CD3+和CD19+比例的影響

2.3.1 分組和給藥 將40只ICR小鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組，模型組，異黃芪甲苷低、中、高劑量（10、20、40 mg/kg）組，每組6只。異黃芪甲苷組每日給藥1次，連續(xù)ig 1周。其他組ig等體積的生理鹽水，在第7天給模型組和異黃芪甲苷組小鼠ip 100 mg/kg的環(huán)磷酰胺。

2.3.2 細胞懸液制備和檢測 脫頸椎處死小鼠，分離小鼠脾臟，置于盛有預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，用研磨棒加適度力度輕輕研磨，于200目篩網(wǎng)濾過，收集細胞，制備單細胞懸液，以冷PBS洗滌細胞2次（1200 r/min，5 min），脾細胞以低滲法裂解紅細胞，細胞計數(shù)，將細胞稀釋至1×107/mL。按上述方法收集淋巴細胞懸液100 μL（1×106/mL）于流式管中，加入抗小鼠CD3、CD19單克隆抗體各0.5 μg，混勻后，4 ℃避光放置30 min。然后用PBS洗滌2次（1200 r/min，5 min），經(jīng)流式細胞儀分析，檢測CD3+和CD19+細胞比例。

2.4 異黃芪甲苷對小鼠樹突狀細胞（dendritic cells，DC）免疫功能的影響

2.4.1 DC的體外培養(yǎng) 取25只小鼠并采集小鼠的外周血單個核細胞5×108～5×109，加入淋巴細胞分離液，使成界面，其體積比為3∶2，1500 r/min，離心15 min，由上到下可分出4層：血清、單個核細胞、淋巴細胞分離液、紅細胞。收集單個核細胞（中間云霧層）于45 mL離心管中，用生理鹽水稀釋，分別以1500、1000、800 r/min離心10 min，洗盡血小板后計數(shù)。以無血清RPMI 1640懸浮沉淀細胞，調(diào)整細胞密度為5×106/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育2 h，輕輕吸出非貼壁細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，用完全RPMI 1640調(diào)整細胞密度為5×106/mL后接種于6孔培養(yǎng)板。

2.4.2 DC的鑒定 采用流式細胞術(shù)直接免疫熒光標記法測定細胞免疫表型，在DC培養(yǎng)的第11天收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，每管取懸液100 μL，分別加入FITC標記的CD11c及PE標記的MHC II單抗各10 μL直接染色，充分混勻后置室溫下暗室反應(yīng)15 min。加PBS液，1000 r/min離心5 min，洗滌后以1%多聚甲醛固定進行流式細胞術(shù)檢測，用CellQuest軟件計算陽性細胞比率。

2.4.3 分組和給藥 細胞分為5組：異黃芪甲苷低、中、高劑量（5、10、50 μmol/L）組，對照組（等體積PBS）和陽性對照組 [10 μg/mL脂多糖（LPS）]，各組設(shè)6個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.4.4 流式細胞術(shù)檢測 收集經(jīng)藥物處理24 h后的DC細胞，以PBS洗2遍，于4 ℃下用10%的羊血清封閉細胞表面抗體15 min，然后加入FITC標記的CD11c或MHC II單抗各10 μL直接染色，于4 ℃下溫育30 min，用PBS洗2遍，然后用PBS重懸細胞置于流式細胞儀上檢測。

2.4.5 DC細胞分泌功能檢測 取細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書要求檢測IL-6和IL-12 p70的濃度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 異黃芪甲苷對巨噬細胞免疫功能的影響

由表1可見，與對照組比較，陽性對照組（IFN-γ）可見中性紅值、IL-2和IL-6水平顯著升高（＜0.05、0.01）；異黃芪甲苷低、中、高3個劑量組亦可見中性紅值、IL-6水平顯著升高（＜0.05、0.01），中、高劑量組IL-2水平顯著升高（＜0.05、0.01），高劑量組IL-1水平明顯升高（＜0.05）。以上結(jié)果提示異黃芪甲苷的免疫促進效應(yīng)與提高巨噬細胞吞噬功能，增加白介素類免疫介質(zhì)的釋放有關(guān)。

3.2 異黃芪甲苷對脾淋巴細胞增殖的影響

與對照組比較，ConA可顯著促進淋巴細胞增殖（＜0.01）。在ConA促進淋巴細胞增殖的基礎(chǔ)上，異黃芪甲苷還可進一步促進淋巴細胞的增殖（＜0.05），提高SI，其中、高劑量組可進一步增加29%。結(jié)果見表2。

表1 異黃芪甲苷對巨噬細胞吞噬和分泌功能的影響(±s,n=6)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

表2 異黃芪甲苷對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響(±s,n=6)

與對照組比較：**＜0.01；與ConA組比較：#＜0.05

**< 0.01control group;#< 0.05ConA group

3.3 異黃芪甲苷對淋巴細胞CD3+和CD19+比例的影響

T淋巴細胞表面表達CD3，不表達CD19，而B細胞相反。由表3和圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠淋巴細胞CD3+比例顯著升高，CD19+比例顯著降低（＜0.01），提示環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用與抑制B淋巴細胞有關(guān)。與模型組比較，異黃芪甲苷低、中、高3個劑量組均可降低CD3+的比例，升高CD19+的比例（＜0.05、0.01），使它們趨于正常，提示異黃芪甲苷具有糾正T、B淋巴細胞紊亂的作用。

3.4 異黃芪甲苷對小鼠DC免疫功能的影響

CD11c和MHC II普遍被認為是DC的表面分子標志，其高表達表明DC的增殖和成熟。由表4和圖3、4可見，與對組比較，LPS處理后不僅DC表達的CD11c和MHC II顯著增加，而且分泌的IL-6和IL-12 p70也顯著升高（＜0.05、0.01），提示LPS可明顯促進DC的分化、成熟，提高其分泌功能。與對照組比較，異黃芪甲苷中、高劑量組CD11c和MHC II的表達水平差異不顯著，IL-6和IL-12 p70水平顯著升高（＜0.05），提示異黃芪甲苷對DC的影響主要是增強其分泌功能，而不是促進其增殖和成熟。

表3 異黃芪甲苷對淋巴細胞CD3+和CD19+比例的影響(±s,n=6)

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01model group

4 討論

芝芪菌質(zhì)（以黃芪藥渣為培養(yǎng)基，靈芝為發(fā)酵菌種，雙向固體發(fā)酵而成）作為本實驗室的自主知識產(chǎn)權(quán)產(chǎn)品，在促進動物生長、提高機體免疫方面已證明具有顯著優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)芝芪菌質(zhì)作為飼料添加劑能顯著促進肉雞生長、提高肉雞機體的免疫力，其血清禽流感H5亞型抗體的滴度和雞新城疫抗體滴度分別比對照組升高2.5、2.4個[6]。此外，還能增加小鼠負重游泳的持續(xù)時間，提高運動后血清尿素氮水平、肝糖元含量及平均體質(zhì)量，表現(xiàn)出較好的抗疲勞及促生長作用[7]。

1998年，異黃芪甲苷首次從分離得到[8]，隨后又相繼在[9]、[10]、[11]、species endemic from Egypt[4]被發(fā)現(xiàn)，然而國內(nèi)未曾從植物中分離得到。Yesilada等[5]研究報道，異黃芪甲苷和黃芪甲苷均具有顯著的生物活性，如在植物血凝素（phytoheagglutinin，PHA）刺激下，它們均能顯著誘導(dǎo)IL-2的生成，活性指數(shù)分別為80.9%和66.0%，顯著高于對照組的51.1%，并且在LPS刺激下，異黃芪甲苷誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β和IL-8的能力甚至強于黃芪甲苷。本實驗獲得的異黃芪甲苷來源于以黃芪藥渣為培養(yǎng)基進行固體發(fā)酵獲得的芝芪菌質(zhì)產(chǎn)物。前期研究已對發(fā)酵時間進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵25 d和30 d的芝芪菌質(zhì)免疫功能增強效果最為明顯[12]。此外還對發(fā)酵產(chǎn)物的不同極性部分進行了免疫活性篩選，發(fā)現(xiàn)芝芪菌質(zhì)水提液、水浸液和40%乙醇洗脫液對免疫功能的促進作用最為明顯[13]。而本次實驗不僅進一步明確了該發(fā)酵產(chǎn)物的免疫活性物質(zhì)基礎(chǔ)為異黃芪甲苷，還通過體內(nèi)外實驗證明該成分的免疫促進作用機制。研究發(fā)現(xiàn)異黃芪甲苷低、中、高3個劑量組可提高巨噬細胞吞噬功能和分泌IL-6的能力，降低CD3+的比例，升高CD19+的比例；中、高劑量組可顯著提高IL-2含量，增加淋巴細胞的增殖，提高SI；高劑量組還可提高巨噬細胞分泌IL-1的能力。免疫低下往往與T、B淋巴細胞比例密切相關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑環(huán)磷酰胺和氫化可的松均可導(dǎo)致CD19+與CD3+的比值降低[14]，這與本實驗結(jié)果一致，而異黃芪甲苷3個劑量均可使它們的比值恢復(fù)，通過糾正淋巴細胞比例，展示了其較好的特異性免疫促進作用。

圖2 流式細胞術(shù)檢測CD3+、CD19+比例

表4 異黃芪甲苷對小鼠DC增殖和分泌功能的影響(±s,n=6)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

圖3 流式細胞術(shù)檢測CD11c含量

圖4 流式細胞術(shù)檢測MHCII含量

1973年Steinman和Cohn首次發(fā)現(xiàn)DC，其對抗原的攝取、加工和遞呈作用對于特異性免疫的形成至關(guān)重要[15]。CD11c和MHC II是DC的生物標志物，并且成熟后表達進一步增加，故常常用于檢測DC的增殖和成熟狀態(tài)[16]。

由于DC有許多突起結(jié)構(gòu)，后者大大增加了表面積，從而允許其與周圍大量細胞（如T細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞、上皮細胞等）密切接觸。DC活性極大，一個成熟的DC可刺激100～3000個T細胞，并且即使沒有明顯的感染或炎癥，它們也可以通過上皮細胞的緊密連接來實現(xiàn)對抗原的捕獲[17]。而其通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）分泌的IL-6和IL-12對T細胞活化的誘導(dǎo)具有重要意義，也是反映其活化功能的關(guān)鍵指標之一[18-19]。本實驗發(fā)現(xiàn)異黃芪甲苷雖然對DC的增殖沒有顯著促進作用，但中、高劑量組可顯著促進DC分泌IL-6和IL-12 p70，從而促進T細胞活化，提高特異性免疫功能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of iso-astragaloside VI on immunologic function of lymphocytesand dendritic cells

RUAN Ming1, YU Bin2, ZHOU Feng1

1. School of Food Science, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China 2. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To study the effect of iso-astragaloside VI (6--β--glucosyl-cycloastragenol) on the function of lymphocytesand dendritic cells.The macrophages were cultured, and the effects of iso-astragaloside VI on helping to devour neutral red and secrete IL-1, IL-2 and IL-6 were also observed. Its effects on proliferating of primary cultured spleen lymphocytes were measured, along with the measurements of CD3 and CD19 by flow cytometry to determine its effects on T and B lymphocytes proliferations. In addition, its effects on promoting the proliferation and secretion of IL-6 and IL-12 p70 in dendritic cells (DC) were also observedThe three groups (low, medium and high doses) of iso-astragaloside VI increased the abilities of macrophages on phagocytosis and secretion of IL-6, improved T and B lymphocytes ratios by decreasing CD3+and enhancing CD19+. Medium and high doses of iso-astragaloside VI elevated IL-2 level, lymphocyte proliferation and SI and promoted secretion of IL-6 and IL-12 p70 from DC. Additionally, the high dose group had the ability to increase the production of IL-1.The potential mechanisms of iso-astragaloside VI on immunoenhancement can promote nonspecific immune phagocytosis, antigen presentation, lymphocyte proliferation and DC secretion.

iso-astragaloside VI; 6--β--glucosyl-cycloastragenol; immunoenhancement; lymphocyte; dendritic cells

R285

A

0253 - 2670(2021)01 - 0196 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.023

2020-03-15

國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFC1605800）；國家自然科學(xué)基金項目（81973726）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20150088）

阮 鳴（1979—），女，博士，副教授，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (025)86178311 E-mail: 1169195814@qq.com

[責任編輯 潘明佳]