王 平，趙 澄，盧芳國(guó)*，吳 濤，張香港，陳純靜，肖 榮，寧 毅，魏 科，李 玲，蔡 琨，田維毅

麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠腸道菌群及趨化因子CCL5、CXCL10的影響

王 平1, 2，趙 澄1，盧芳國(guó)1*，吳 濤1，張香港1，陳純靜1，肖 榮1，寧 毅1，魏 科1，李 玲1，蔡 琨2，田維毅2

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

探索麻杏石甘湯（Maxing Shigan Decoction）通過(guò)影響小鼠腸道菌群組成及趨化因子產(chǎn)生而防治流感病毒感染的潛在機(jī)制。通過(guò)鼻腔接種法建立A型流感病毒感染小鼠模型，經(jīng)ig給藥3 d和7 d后，觀察小鼠體質(zhì)量等一般情況；HE染色檢測(cè)結(jié)腸組織病理變化；免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織趨化因子CCL5、CXCL10的表達(dá)；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)腸組織中CCL5、CXCL10含量，并取小鼠腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)測(cè)序、物種注釋及聚類，進(jìn)行Alpha多樣性和Beta多樣性分析，線性判別式分析 [linear discriminant analysis（LDA）effect size，LEfSe] 篩選組間差異物種，冗余分析及Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析腸道菌群與CCL5、CXCL10的關(guān)聯(lián)性。給藥3 d后，模型組小鼠體質(zhì)量下降（＜0.01），腸黏膜固有層中炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)且高表達(dá)CCL5和CXCL10（＜0.01），結(jié)腸組織勻漿中CCL5和CXCL10含量增加（＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠體質(zhì)量明顯增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，CCL5、CXCL10陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少，腸組織勻漿中CCL5、CXCL10含量降低，以?shī)W司他韋組和麻杏石甘湯組差異顯著（＜0.05、0.01）。菌群多樣性分析和物種差異分析結(jié)果顯示，給藥3 d后，模型組小鼠腸道菌群組成與對(duì)照組及各藥物組存在明顯差異。模型組小鼠變形菌門、埃希菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯增加（＜0.05），厚壁菌門、乳桿菌屬、糞球菌屬相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各藥物組變形菌門、埃希菌屬相對(duì)豐度降低（＜0.05），奧司他韋組和麻杏石甘湯組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著增加（＜0.01），抗病毒顆粒組顫螺旋菌屬相對(duì)豐度增加（＜0.05），麻杏石甘湯組乳桿菌屬、糞球菌屬相對(duì)豐度增加（＜0.05、0.01）。給藥7 d后，模型組小鼠結(jié)腸組織病變減輕，趨化因子表達(dá)下降，變形菌門、埃希菌屬相對(duì)豐度較給藥3 d后明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，各藥物組疣微菌門相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05、0.01），擬桿菌門相對(duì)豐度明顯升高（＜0.05）。關(guān)聯(lián)性分析顯示，小鼠結(jié)腸組織中CCL5、CXCL10含量與埃希菌屬、克雷伯菌屬、梭菌屬、糞球菌屬等相對(duì)豐度顯著相關(guān)（＜0.05、0.01）。A型流感病毒感染可引起小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂及免疫功能失衡，麻杏石甘湯通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)并影響趨化因子的產(chǎn)生，對(duì)流感病毒引起的腸道免疫損傷有一定的保護(hù)作用。

A型流感病毒；麻杏石甘湯；腸道菌群；趨化因子；CCL5；CXCL10

流行性感冒（以下簡(jiǎn)稱流感）是由流感病毒（influenza virus）引起的一種急性呼吸道傳染病。A型流感病毒（influenza A virus，IAV）是引起人和動(dòng)物感染的主要病原體。流感臨床表現(xiàn)多樣，常見(jiàn)的癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、頭痛、乏力，并常伴有惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等消化道癥狀。有研究報(bào)道，流感患者胃腸道癥狀發(fā)生率為30.9%[1]。流感病毒感染致腸道菌群失調(diào)及黏膜局部免疫功能紊亂可能是流感容易出現(xiàn)消化道癥狀的重要原因[2]。

腸道菌群從生命早期開(kāi)始逐步有序地定植在消化道內(nèi)，形成穩(wěn)定的腸道微生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與宿主的能量代謝、免疫穩(wěn)態(tài)以及健康狀況密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道菌群種類和比例改變對(duì)流感病毒感染的結(jié)局可能產(chǎn)生積極影響或負(fù)面作用，這與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對(duì)宿主免疫功能的影響密不可分[3]。研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后，腸道菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變，并且腸上皮細(xì)胞可以釋放過(guò)量的趨化因子和促炎細(xì)胞因子，腸道菌群與黏膜局部炎癥因子之間相互作用，進(jìn)而影響流感的進(jìn)程[2,4]。Wang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染可促進(jìn)肺源性CCR9+CD4+T細(xì)胞進(jìn)入腸道，分泌γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）干擾腸道微生物群穩(wěn)態(tài)，引起腸道菌群失調(diào)，而紊亂的腸道菌群又可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15），誘導(dǎo)Th17細(xì)胞極化，促進(jìn)IL-17等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而加重腸組織損傷。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染可促進(jìn)腸道中變形菌門腸桿菌科細(xì)菌生長(zhǎng)，破壞黏膜屏障功能，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)IL-22、IFN-α、IL-17A等促炎細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)和腸組織損傷。趨化因子CCL5（CC chemokine ligand 5）和CXCL10（C-X-C motif chemokine ligand 10）是引起流感免疫病理?yè)p傷的重要炎癥因子，能強(qiáng)烈趨化炎癥細(xì)胞向病灶部位聚集，與流感病毒感染引起的炎癥損傷程度呈正相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌或肺炎克雷伯菌等可以促進(jìn)CCL5及CXCL10等趨化因子的表達(dá)，從而加重炎性損傷程度[7-8]。因此，修復(fù)腸道微生態(tài)失衡，改善黏膜局部微環(huán)境對(duì)于防治流感有重要意義。源自漢代張仲景《傷寒論》的麻杏石甘湯（Maxing Shigan Decoction，MXSGD）是常用的防治流感的中藥經(jīng)方。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方具有干預(yù)病毒吸附、抑制病毒增殖、抑制趨化因子及炎癥介質(zhì)釋放等作用[9-11]。本研究以流感病毒感染BALB/c小鼠為模型，探討流感病毒對(duì)小鼠腸道菌群及腸黏膜局部趨化因子的影響，及MXSGD的干預(yù)作用，以期為腸道菌群作為流感防控新策略中的重要靶點(diǎn)提供依據(jù)，并進(jìn)一步揭示MXSGD防治流感的可能機(jī)制，為拓展其臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

6～8周BALB/c雄性小鼠60只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 [許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物批號(hào)43004700062561]，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（湘）2015-0003] 飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（23±1）℃，濕度（65±5）%。所有實(shí)驗(yàn)符合湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 病毒株

流感病毒小鼠肺適應(yīng)株（A型，IAV，A/PR/8/34），由湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈(zèng)。10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價(jià)1∶640以上者用于實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)前根據(jù)文獻(xiàn)方法[12]，測(cè)定小鼠病毒半數(shù)致死量（LD50）為1×10?3.77，每0.1 毫升病毒液用滅菌生理鹽水稀釋成50 LD50，置于冰袋中備用。

1.3 藥物與試劑

MXSGD（麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、炙甘草6 g）：麻黃（批號(hào)1901029）、杏仁（批號(hào)2019032702）、石膏（碎，棉裹，批號(hào)1905250032）、炙甘草（批號(hào)1806004），購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部戴冰教授鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》2020年版的要求；磷酸奧司他韋膠囊（規(guī)格75 mg/粒，批號(hào)M1050，意大利Roche S.p.A. 公司生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝）購(gòu)自中南大學(xué)湘雅二附院門診藥房，用蒸餾水充分溶解，制成質(zhì)量濃度為2.165 mg/mL的混懸液；抗病毒顆粒（規(guī)格9 g/袋，批號(hào)1906311，四川光大制藥有限公司）購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診藥房，用蒸餾水充分溶解，制成質(zhì)量濃度為0.39 g/mL的溶液。以上實(shí)驗(yàn)用藥4 ℃避光保存?zhèn)溆?。兔抗小鼠RANTES抗體（批號(hào)ab189841）、CXCL10多克隆抗體（批號(hào)ab9938）；驢抗兔IgG熒光二抗（批號(hào)ab175772）均購(gòu)于Abcam公司；通用二步法試劑盒（批號(hào)PV-9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；小鼠CXCL10/IP-10 ELISA試劑盒（批號(hào)F10933，上海西唐生物科技有限公司）、CCL5/ Rantes ELISA試劑盒（批號(hào)F11450，上海西唐生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器

BSC-1300 IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Axioscope 5光學(xué)掃描顯微鏡＋Axiocam 503 color 顯微鏡攝像頭 [蔡司科技（蘇州）有限公司]；BBY24M高通量組織細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Next Advance公司）；Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；TP-200D電子分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；RMZ135精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；TGL 20M高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；IlluminaMiseq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、奧司他韋組（化學(xué)藥對(duì)照組）、抗病毒顆粒組（中藥對(duì)照組）和MXSGD組，每組12只小鼠。

2.2 MXSGD水煎液的制備

參照文獻(xiàn)方法[13-14]，采用麻黃先煎方法制備MXSGD水煎液。按其組成比例分別稱量5劑藥的藥材量。先取麻黃45 g，加入藥材總量10倍體積的蒸餾水，武火煎煮，待沸騰后，調(diào)整為文火煎煮25 min，去沫，再加入石膏90 g、杏仁45 g、炙甘草30 g，繼續(xù)文火煎煮30 min，煎煮完畢后濾過(guò)；二煎加入7倍體積蒸餾水武火煮沸后再文火煎煮20 min，煎煮完畢后濾過(guò)，合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥0.605 g/mL，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 模型制備及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后稱質(zhì)量。除對(duì)照組外，各組小鼠按照本課題前期研究已建立的方法建立A型流感病毒感染模型[15]。用乙醚輕度麻醉小鼠后，每只小鼠鼻孔內(nèi)均勻滴入50 LD50流感病毒液0.05 mL，建立模型。對(duì)照組小鼠隔離飼養(yǎng)在同等條件下的房間，并按同樣方法鼻腔接種0.9%氯化鈉溶液0.05 mL。

按臨床等效劑量（臨床等效劑量按動(dòng)物每千克體質(zhì)量占人體表面積的比值計(jì)算[16]）于感染后24 h開(kāi)始ig給藥，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥3 d和7 d。奧司他韋、抗病毒顆粒、MXSGD的給藥劑量分別為20.14 mg/(kg?d)、4.03 mL/(kg?d)、5.22 g/(kg?d)。對(duì)照組和模型組均ig等量生理鹽水。

2.4 標(biāo)本采集

分別于感染后第4天和第8天（給藥后第3天和第7天），禁水禁食8 h后，每組隨機(jī)選取6只小鼠，稱質(zhì)量后，摘眼球放血法處死小鼠，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖，用無(wú)菌鑷子將部分結(jié)腸段內(nèi)容物取下，置于EP管中，凍存于?80 ℃冰箱。收集一部分結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定；另一部分稱重后，液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)結(jié)腸組織病理變化，用4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織、石蠟包埋、切片（4～5 μm）、HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下（×200）觀察病理變化。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)趨化因子CCL5、CXCL10在腸黏膜表達(dá)

PV-9000通用二步法檢測(cè)腸組織中趨化因子CCL5、CXCL10蛋白表達(dá)水平。石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，與CCL5、CXCL10一抗37 ℃孵育60 min，陰性對(duì)照組用PBS緩沖液代替一抗，PBS緩沖液沖洗后滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min，加DAB顯色劑處理5～8 min，蘇木素復(fù)染1 min，流水沖洗30 min，氨水返藍(lán)，脫水、透明、封片，鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)棕褐色或者棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞，以細(xì)胞不著色為陰性。用Axiocam 503 color采集圖像，選取結(jié)構(gòu)完整的1張切片，在高倍鏡下（×200），每張切片任選5個(gè)視野，用Image-proplus分析軟件進(jìn)行陽(yáng)性顯色的平均積分光密度測(cè)定（陽(yáng)性區(qū)域面積陽(yáng)性強(qiáng)度），代表陽(yáng)性細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)量，然后求其平均值，作為該樣本的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 ELISA法檢測(cè)CCL5、CXCL10在腸組織勻漿中的含量

從液氮中取出凍存結(jié)腸標(biāo)本，標(biāo)本融化后，剪碎，加入一定量預(yù)冷的PBS（pH 7.4），將標(biāo)本充分勻漿（制備成10%勻漿），離心20 min（4 ℃、2000 r/min），嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，運(yùn)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.8 16S rRNA基因V3～V4區(qū)測(cè)序

采用Macherey-Nagel Kit試劑盒抽提腸內(nèi)容物DNA，通過(guò)Qubit Fluorometer對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)，DNA質(zhì)量符合的樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。取30 ng DNA樣品及融合引物（341F：5’-ACTCCTACGGGA- GGCAGCAG-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWT- CTAAT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（16S rRNA基因V3～V4區(qū)）。純化后溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，文庫(kù)構(gòu)建完成。采用IlluminaMiseqPE 300高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行雙末端（paired-end，PE）測(cè)序，獲得PE讀段（reads）。16S rRNA基因測(cè)序分析由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司高通量實(shí)驗(yàn)室完成。

2.9 生物信息學(xué)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除低質(zhì)量的reads，使用FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11）軟件，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads拼接成原始序列（raw tags）；raw tags經(jīng)進(jìn)一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列（clean tags）。利用UPARSE軟件在97%相似度下將優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），通過(guò)RDP classifer軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)Greengene比對(duì)，得到每個(gè)樣本的物種分類信息，并在各個(gè)水平（門，綱，目，科，屬，種）進(jìn)行物種注釋?；诰垲惤Y(jié)果，進(jìn)行Alpha多樣性分析 [Chao1指數(shù)（）、Ace指數(shù)（Ace）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、辛普森指數(shù)（）]和Beta多樣性分析 [層級(jí)聚類樹(shù)分析（hierarchical clustering tree analysis）和主成分分析（principal component analysis，PCA）]。采用線性判別式分析 [linear discriminant analysis（LDA）effect size，LEfSe] 找到組間在豐度上有差異的物種，結(jié)果用LDA值分布柱狀圖及進(jìn)化分支圖表示，LDA值（log 10）＞2的物種被認(rèn)為具有顯著性差異[17]。使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）及Spearman系數(shù)分析腸道菌群與趨化因子水平的相關(guān)性。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

給藥3 d后，對(duì)照組小鼠食欲旺盛、外觀肥滿、被毛光澤、行動(dòng)敏捷、呼吸均勻、大小便正常、體溫正常、體質(zhì)量無(wú)明顯變化。模型組食欲減退、被毛雜亂、豎毛明顯、弓背、扎堆、精神萎靡、倦怠懶動(dòng)、呼吸短促、腹式呼吸明顯，小便正常，大便稀軟不成形，體溫降低、體質(zhì)量下降。與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，圖1）。各藥物治療組小鼠呼吸漸平穩(wěn)，被毛光澤度良好，大便濕潤(rùn)成型，體質(zhì)量減輕后漸恢復(fù)。與模型組比較，各藥物治療組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，圖1）。給藥7 d后，對(duì)照組和各藥物組小鼠一般情況良好，模型組小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，大便漸成形，體質(zhì)量增加，但與對(duì)照組和MXSGD組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖1）。

3.2 小鼠結(jié)腸組織病理變化

光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理切片，結(jié)果見(jiàn)圖2。給藥3 d后，對(duì)照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜排列整齊，腺體無(wú)萎縮，黏膜下未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組結(jié)腸黏膜上皮水腫，部分腺體萎縮，黏膜固有層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)藥物干預(yù)后，結(jié)腸組織損傷得到不同程度改善，固有層細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。給藥7 d后，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較給藥3 d后有所減輕，各藥物組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，與對(duì)照組結(jié)構(gòu)相似。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.3 小鼠結(jié)腸組織CCL5、CXCL10蛋白表達(dá)

由圖3、4可見(jiàn)，CCL5和CXCL10主要表達(dá)于胞漿或胞膜上。模型組結(jié)腸黏膜固有層中可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，對(duì)照組和各藥物組小鼠腸黏膜中也可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，尤其以CCL5表達(dá)更廣泛。由表1可知，給藥3 d后，模型組CCL5表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（＜0.01），奧司他韋組、MXSGD組CCL5表達(dá)量較模型組顯著降低（＜0.01）；模型組CXCL10表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（＜0.01），奧司他韋組、MXSGD組CXCL10表達(dá)量較模型組顯著降低（＜0.01）。給藥7 d后，模型組CCL5表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高（＜0.05），MXSGD組CCL5表達(dá)量較模型組明顯降低（＜0.05）；各組CXCL10表達(dá)無(wú)顯著差異。由上述結(jié)果可知，正常情況下，小鼠結(jié)腸組織中少量表達(dá)CCL5和CXCL10。流感病毒感染可致結(jié)腸組織CCL5和CXCL10過(guò)量表達(dá)。經(jīng)藥物治療后，CCL5和CXCL10表達(dá)均有不同程度下降，與抗病毒顆粒比較，奧司他韋與MXSGD能更好地降低CCL5和CXCL10表達(dá)水平。給藥7 d后，模型組CCL5仍高于對(duì)照組（＜0.05），MXSGD組CCL5表達(dá)低于模型組（＜0.05）。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化 (HE染色，×200)

圖3 CCL5在各組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá) (PV-9000通用二步法，×200)

圖4 CXCL10在各組小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá) (PV-9000通用二步法，×200)

表1 各組小鼠結(jié)腸組織CCL5、CXCL10平均光密度值(±s, n = 6)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，圖5同

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as Figure 5

3.4 小鼠結(jié)腸組織中CCL5、CXCL10的含量

結(jié)果見(jiàn)圖5。給藥3 d后，模型組小鼠結(jié)腸組織中CCL5含量明顯高于對(duì)照組（＜0.01）；奧司他韋組、MXSGD組CCL5含量明顯低于模型組（＜0.05）；給藥7 d后，各組小鼠結(jié)腸組織中CCL5含量無(wú)顯著差異。給藥3 d后，模型組小鼠結(jié)腸組織中CXCL10含量明顯高于對(duì)照組（＜0.01）；奧司他韋組、抗病毒顆粒組、MXSGD組CXCL10含量明顯低于模型組（＜0.05、0.01）；給藥7 d后，各組小鼠結(jié)腸組織中CXCL10含量無(wú)顯著差異。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織勻漿CCL5和CXCL10含量

3.5 OTU聚類分析

5組小鼠2個(gè)時(shí)間點(diǎn)共收集30個(gè)結(jié)腸內(nèi)容物樣品（每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)樣品），全部建庫(kù)合格，共獲得1 086 473條高質(zhì)量的tags，以97%相似度聚類，共獲得483個(gè)OTU，測(cè)序覆蓋深度（覆蓋指數(shù)）0.998 8，平均每個(gè)樣品288個(gè)OTU，歸屬于9個(gè)門、50個(gè)屬。

3.6 物種分布——微生物群落結(jié)構(gòu)分析

3.6.1 門（Phylum）水平分布 給藥治療后，各組小鼠的腸道優(yōu)勢(shì)菌門構(gòu)成及相對(duì)豐度如圖6和表2所示。腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門以厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主。給藥3 d后，與對(duì)照組比較，模型組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著降低（＜0.01），變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度明顯增加（＜0.05），厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B）降低，但差異不顯著；與模型組比較，奧司他韋組和MXSGD組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著增加（＜0.01），F(xiàn)/B值明顯增加（＜0.05）；各藥物組變形菌門相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05）。給藥7 d后，模型組疣微菌門（Verrucomicrobia）相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組、抗病毒顆粒組、MXSGD組疣微菌門相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05、0.01），擬桿菌門相對(duì)豐度明顯升高（＜0.05）。與給藥3 d后比較，給藥7 d后，模型組變形菌門相對(duì)豐度顯著下降（＜0.01），F(xiàn)/B值明顯增加（＜0.05）。

3.6.2 屬水平分布 各組小鼠腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌屬構(gòu)成及相對(duì)豐度如圖7及表3所示。給藥3 d后，正常菌群優(yōu)勢(shì)菌屬包括：（10.97%）、顫螺旋菌屬（6.76%）、艾克曼菌屬（6.27%）、（5.29%）、擬桿菌屬（2.62%）、乳桿菌屬（1.90%）、糞球菌屬（1.11%）、瘤胃球菌屬（3.46%）等；與對(duì)照組比較，模型組糞球菌屬、乳桿菌屬、普雷沃菌屬相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05），埃希菌屬（）相對(duì)豐度明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，奧司他韋組、抗病毒顆粒組和MXSGD組埃希菌屬相對(duì)豐度明顯降低（＜0.05），抗病毒顆粒組顫螺旋菌屬相對(duì)豐度明顯增加（＜0.05），MXSGD組糞球菌屬、乳酸桿菌屬相對(duì)豐度明顯增加（＜0.05、0.01）。給藥7 d后，對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬包括：普雷沃菌屬（11.19%）、顫螺旋菌屬（8.01%）、乳桿菌屬（5.84%）、瘤胃球菌屬（2.00%）等；與對(duì)照組比較，模型組顫螺旋菌屬相對(duì)豐度明顯下降（＜0.05）；與給藥3 d后比較，給藥7 d后，模型組埃希菌屬相對(duì)豐度顯著下降（＜0.01）。

3.7 Alpha多樣性指數(shù)分析

常用的Alpha多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用來(lái)評(píng)價(jià)菌群的豐富度，數(shù)值越大，說(shuō)明該菌群豐富度越高。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要用來(lái)評(píng)價(jià)菌群多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。給藥3 d和7 d后各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表4。給藥3 d后，與對(duì)照組比較，模型組Chao1、ACE、Shannon指數(shù)降低，Simpson指數(shù)增高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，抗病毒顆粒組Chao1、ACE指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。奧司他韋組、抗病毒顆粒組、MXSGD組Shannon指數(shù)均顯著增高，Simpson指數(shù)均顯著降低（＜0.01）；給藥7 d后，與對(duì)照組比較，模型組Shannon指數(shù)明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，抗病毒顆粒組Shannon指數(shù)明顯增高（＜0.05）。上述結(jié)果提示，流感病毒感染4 d后（給藥3 d后），模型組小鼠腸道菌群豐富度和多樣性明顯降低，抗病毒顆粒能增加小鼠腸道菌群豐富度和多樣性；奧司他韋、MXSGD能增加小鼠腸道菌群多樣性；流感病毒感染8 d后（給藥7 d后），模型組小鼠腸道菌群多樣性仍低于對(duì)照組，抗病毒顆?？梢栽黾有∈竽c道菌群多樣性。

圖6 各組小鼠腸道菌群在門水平上分布

表2 各組小鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度 (±s, n = 3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；與給藥3 d后比較：^＜0.05 ^^＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group; ^< 0.05 ^^< 0.01corresponding groups after 3 d of administration

圖7 各組小鼠腸道菌群在屬水平分布

表3 各組小鼠腸道菌群屬水平相對(duì)豐度(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；與給藥治療3 d比較：^＜0.05 ^^＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model control group; ^< 0.05 ^^< 0.01corresponding groups after 3 d of administration

3.8 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要對(duì)不同樣品/不同組間樣品微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，常用PCA和層級(jí)聚類樹(shù)分析。PCA是常用的一種降維分析方法，通過(guò)將方差進(jìn)行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，圖中兩樣品點(diǎn)距離越近，表示它們的物種組成越相似，反之亦然。層級(jí)聚類樹(shù)可以清楚看出每個(gè)樣品的距離遠(yuǎn)近，根據(jù)樹(shù)枝的距離可以劃分出不同的分組。PCA結(jié)果（圖8-a）提示，給藥3 d后，模型組各樣品點(diǎn)與對(duì)照組樣品點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，表明兩組樣品之間細(xì)菌群落組成存在明顯差異，說(shuō)明流感病毒感染可以影響正常小鼠腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)。藥物治療組各樣品點(diǎn)與對(duì)照組各樣品點(diǎn)距離接近，且明顯偏離于模型對(duì)照組各樣品點(diǎn)，提示藥物組群落組成與對(duì)照組更相似。層級(jí)聚類樹(shù)分析結(jié)果（圖8-b）提示，模型組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他各組有明顯差異。說(shuō)明奧司他韋、抗病毒顆粒和MXSGD均可以調(diào)節(jié)流感病毒感染后小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)。給藥7 d后，各組PCA與層級(jí)聚類樹(shù)分析結(jié)果（圖8-c、d）提示，PCA結(jié)果顯示模型組樣品點(diǎn)仍然偏離于其余各組樣品點(diǎn)，各藥物組樣品點(diǎn)與對(duì)照組樣品點(diǎn)間距離較給藥3 d后更接近。層級(jí)聚類樹(shù)分析結(jié)果顯示，MXSGD組與對(duì)照組腸道菌群組成更相似。

表4 各組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group

a、c-PCA b、d-層級(jí)聚類樹(shù)分析 A1～A3、F1～F3-對(duì)照組 B1～B3、G1～G3-模型組 C1～C3、H1～H3-奧司他韋組 D1～D3、I1～I(xiàn)3-抗病毒顆粒組 E1～E3、J1～J3-MXSGD組

3.9 組間差異物種的篩選

采用LEfSe篩選組間具有顯著差異的物種。LDA值超過(guò)設(shè)定值（常以＞3.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)）的物種，即被認(rèn)為是組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)記物（biomarker），并根據(jù)差異物種繪制物種進(jìn)化分支圖。在進(jìn)化分支圖中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表由界至屬（或種）的分類級(jí)別。在不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類，小圓圈直徑大小與相對(duì)豐度大小呈正比。無(wú)顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種生物標(biāo)記物跟隨組進(jìn)行著色。圖9-a～h顯示，給藥3 d后，模型組與其他各組比較具有顯著差異的優(yōu)勢(shì)物種為變形菌門、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌屬、克雷伯菌屬、沙雷氏菌屬、變形桿菌屬，疣微菌門、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、脫鐵桿菌目（Deferribacterales）、脫鐵桿菌屬、多拉菌屬等；與模型組比較，對(duì)照組具有顯著優(yōu)勢(shì)的物種為厚壁菌門、梭菌綱（Clostridia）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、瘤胃菌屬、顫螺旋菌屬、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、糞球菌屬、紅蝽菌綱（Coriobacteriia）、紅蝽菌目（Coriobacteriales）、紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）、羅斯氏菌屬等；奧司他韋組具有顯著優(yōu)勢(shì)的物種為厚壁菌門、梭菌綱、瘤胃球菌科、顫螺旋菌屬、乳桿菌目（Lactobacillales）等；抗病毒顆粒組具有顯著優(yōu)勢(shì)的物種為厚壁菌門、梭菌綱、瘤胃球菌科、顫螺旋菌屬；MXSGD組具有顯著優(yōu)勢(shì)的物種為普雷沃菌科（Prevotellaceae）、普雷沃菌屬、厚壁菌門、梭菌綱、瘤胃球菌科、顫螺旋菌屬、乳桿菌目、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬、毛螺菌科、糞球菌屬、丁酸梭菌屬等。給藥7 d天后，各組間顯著差異物種不明顯（LDA值＜3.5）。

a-對(duì)照組和模型組LDA值分布柱狀圖 b-對(duì)照組和模型組進(jìn)化分支圖 c-模型組和奧司他韋組LDA值分布柱狀圖 d-模型組和奧司他韋組進(jìn)化分支圖 e-模型組和抗病毒顆粒組LDA值分布柱狀圖 f-模型組和抗病毒顆粒組進(jìn)化分支圖 g-模型組和MXSGD組LDA值分布柱狀圖 h-模型組和MXSGD組進(jìn)化分支圖

a-histogram of LDA scores in normal control group and model control group b-cladogram in normal control group and model control group c- histograms of LDA scores in model control group and oseltamivir group d-cladogram in model control group and oseltamivir group e-histograms of LDA scores in model control group and antivirus granule group f-cladogram in model control group and antivirus granule group g-histograms of LDA scores in model control group and MXSGD group h-cladogram in model control group and MXSGD group

圖9 各組小鼠腸道菌群LEfSE差異分析結(jié)果

Fig. 9 LEfSE difference analysis in various groups

3.10 腸道菌群與趨化因子關(guān)聯(lián)性分析

通過(guò)RDA及Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析各組小鼠結(jié)腸組織中趨化因子CCL5、CXCL10與腸道菌群的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果（圖10）顯示，小鼠腸道菌群的分布與腸黏膜趨化因子CCL5和CXCL10含量的相關(guān)性具有顯著性差異。在門水平上：變形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、擬桿菌門與CCL5和CXCL10含量呈正相關(guān)；厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）與CCL5和CXCL10含量呈負(fù)相關(guān)。在屬水平上：埃希菌屬、梭菌屬、變形桿菌屬、克雷伯菌屬、沙雷氏菌屬、擬桿菌屬、屬與CCL5和CXCL10含量呈正相關(guān)；乳桿菌屬、厭氧棒狀菌屬、糞球菌屬、顫螺旋菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、丁酸梭菌屬、低嗜鹽細(xì)菌屬與CCL5和CXCL10含量呈負(fù)相關(guān)。其中，埃希菌屬、克雷伯菌屬、梭菌屬、變形菌屬、沙雷氏菌屬、糞球菌屬、厭氧棒狀菌屬與CCL5和CXCL10相關(guān)性顯著（＜0.05、0.01）；低嗜鹽細(xì)菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬與CCL5相關(guān)性顯著（＜0.05、0.01）；顫螺旋菌屬與CXCL10相關(guān)性顯著（＜0.05）。

a-RDA分析（門水平） b-RDA分析（屬水平） c-Spearman相關(guān)熱圖 A1～A3-對(duì)照組 B1～B3-模型組 C1～C3-奧司他韋組 D1～D3-抗病毒顆粒組 E1～E3-MXSGD組

4 討論

MXSGD為漢代張仲景《傷寒論》名方，具有宣肺平喘、祛除寒濕、通腑瀉熱兼燥濕健脾之功效，是治療證屬熱毒襲肺和熱毒壅肺流感的基本方[18]。2019年12月以來(lái)爆發(fā)的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情中，MXSGD是國(guó)家及各地方衛(wèi)生管理部門發(fā)布的診療方案中被推薦使用頻次最高的中藥方劑之一[19]，是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的系列《新型冠狀病毒的肺炎診療方案》中推薦在臨床治療期使用的“清肺排毒湯”的重要組成部分[20]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子可能是流感“肺病及腸”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[11]。流感病毒感染的單核/巨噬細(xì)胞可迅速產(chǎn)生CC家族趨化因子（如CCL5），以及CXC家族趨化因子（如CXCL10），這些趨化因子的急劇升高與流感病毒感染引起的炎癥病理?yè)p傷密切相關(guān)。CCL5也被命名為RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted），由上皮細(xì)胞、CD8+T、CD4+T、單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用，能促進(jìn)白細(xì)胞向炎癥部位遷移和浸潤(rùn)。CXCL-10又被稱作γ干擾素誘導(dǎo)蛋白（interferon-gamma-induced protein，IP-10），是一種屬于CXC趨化因子家族的小分子蛋白質(zhì)，與流感病毒感染引起的肺部損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，由IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、病毒RNA等誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可趨化T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，促進(jìn)IFN-γ、IL-6、IL-8等多種促炎細(xì)胞因子分泌[21]。因此，抑制CCL5和CXCL10過(guò)表達(dá)，對(duì)于控制流感病毒感染引起的炎癥反應(yīng)有重要意義。

已有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可影響宿主局部或全身免疫功能。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）是腸道有益菌發(fā)酵膳食纖維的重要產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。已有研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門是丁酸鹽的重要來(lái)源，丁酸鹽是細(xì)胞的主要能量底物，厚壁菌門和擬桿菌門比值降低可以直接影響腸道菌群對(duì)膳食纖維代謝，使SCFAs濃度降低，厚壁菌門減少可誘發(fā)或加重局部炎癥反應(yīng)[22]。變形菌門是腸道的4個(gè)主要菌門（厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門）中隨時(shí)間變化最不穩(wěn)定的菌門，變形菌門豐度增加被視為反映腸道菌群紊亂的一個(gè)標(biāo)志及潛在的疾病診斷指標(biāo)[23]。變形菌門能夠有效利用炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的硝酸鹽作為電子受體，進(jìn)行厭氧呼吸，因此在炎癥環(huán)境中，比依賴發(fā)酵生長(zhǎng)的厚壁菌門和擬桿菌門更具增殖優(yōu)勢(shì)，其過(guò)度生長(zhǎng)可進(jìn)一步加重局部炎癥反應(yīng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）的產(chǎn)生和分化，從而促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10產(chǎn)生，并且可以強(qiáng)烈減少促炎趨化因子CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11的釋放，從而抑制白細(xì)胞遷徙，具有很強(qiáng)的抗炎作用[24]。普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬、丁酸梭菌屬、乳酸桿菌屬均可增加腸道內(nèi)SCFAs含量，誘導(dǎo)小鼠腸道中Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，發(fā)揮炎癥抑制作用[25-27]。顫螺旋菌屬在炎癥疾病中豐度降低，與健康呈正相關(guān)，對(duì)人體健康具有潛在的重要性[28]。而過(guò)度生長(zhǎng)的大腸埃希菌或肺炎克雷伯菌等可以促進(jìn)CCL5及CXCL10等趨化因子的表達(dá)，從而加重炎性損傷程度[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后模型組小鼠腸黏膜出現(xiàn)明顯病理變化，黏膜下層和固有層中見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞胞漿和胞膜上有大量趨化因子CCL5和CXCL10表達(dá)。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示模型組小鼠腸道菌群豐富度和多樣性明顯降低。Beta多樣性分析結(jié)果顯示模型組小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)與對(duì)照組和各藥物組明顯不同。病毒感染后第4天，與對(duì)照組比較，模型組厚壁菌門相對(duì)豐度明顯下降，厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B）明顯降低，變形菌門相對(duì)豐度顯著增加，埃希菌屬相對(duì)豐度增加，糞球菌屬、乳桿菌屬、普雷沃菌屬豐度下降。LEfSe分析結(jié)果顯示，克雷伯菌屬也是模型組的優(yōu)勢(shì)菌屬。經(jīng)藥物治療3 d后，各藥物組腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，CCL5及CXCL10表達(dá)明顯降低；Alpha多樣性分析結(jié)果顯示各藥物組腸道菌群多樣性增加，抗病毒顆粒組菌群豐富度增加；Beta多樣性分析結(jié)果顯示，在各藥物組中，MXSGD組小鼠腸道菌群組成更接近對(duì)照組；與模型組比較，各藥物組變形菌門、埃希菌屬相對(duì)豐度均降低，奧司他韋組和MXSGD組厚壁菌門相對(duì)豐度及F/B值明顯增加，MXSGD組乳桿菌屬和糞球菌屬相對(duì)豐度顯著增加；此外，LEfSe分析的結(jié)果提示，MXSGD組的優(yōu)勢(shì)物種還包括瘤胃球菌科、顫螺旋菌屬、毛螺菌科、丁酸梭菌屬等。通過(guò)相關(guān)性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，埃希菌屬、克雷伯菌屬、變形桿菌屬等與CCL5和CXCL10含量呈顯著正相關(guān)，糞球菌屬、厭氧棒狀菌等與CCL5和CXCL10含量呈顯著負(fù)相關(guān)，乳桿菌屬與CCL5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，顫螺旋菌屬與CXCL10含量呈顯著負(fù)相關(guān)。CCL5和CXCL10表達(dá)下調(diào)，也可能會(huì)影響抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ產(chǎn)生，從而影響機(jī)體抗病毒感染免疫。但前期研究[29]發(fā)現(xiàn)，MXSGD可以促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2產(chǎn)生，IL-2可以刺激T細(xì)胞快速增殖分化產(chǎn)生IFN-γ?？梢?jiàn)，MXSGD可以通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，減少炎癥因子表達(dá)下調(diào)對(duì)機(jī)體抗感染免疫帶來(lái)的負(fù)面影響。

綜上所述，流感病毒感染后，小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)明顯紊亂，且結(jié)腸組織中趨化因子CCL5和CXCL10的表達(dá)明顯增強(qiáng)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腸道菌群與趨化因子CCL5和CXCL10表達(dá)顯著相關(guān)。奧司他韋、抗病毒顆粒和MXSGD均能夠不同程度修復(fù)流感病毒感染后紊亂的腸道菌群，并降低結(jié)腸組織中趨化因子CCL5和CXCL10的表達(dá)。與其他藥物組比較，MXSGD組腸道菌群結(jié)構(gòu)更接近對(duì)照組水平，MXSGD能更好促進(jìn)乳桿菌屬和糞球菌屬益生菌生長(zhǎng)，且對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的CCL5和CXCL10過(guò)表達(dá)均有一定的抑制作用。因此，腸道菌群可以作為MXSGD防治流感的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，MXSGD可能通過(guò)調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而下調(diào)趨化因子水平，緩解流感病毒感染所致免疫炎癥損傷，其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of Maxing Shigan Decoction on intestinal flora and chemokines CCL5 and CXCL10 in mice infected with influenza virus

WANG Ping1, 2, ZHAO Cheng1, LU Fang-guo1, WU Tao1, ZHANG Xiang-gang1, CHEN Chun-jing1, XIAO Rong1, NING Yi1, WEI Ke1, LI Ling1, CAI Kun2, TIAN Wei-yi2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Guizhou University of Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

To investigate the potential mechanism of Maxing Shigan Decoction (MXSGD, 麻杏石甘湯) by affecting the intestinal flora and chemokines in mice in order to prevent and treat the influenza virus infection.The infected mice model of influenza A virus was established by intranasal inoculation. After 3 and 7 d of gavage administration or saline, the state of mice was observed. Colon tissue was detected by HE staining. The expressions and contents of chemokines CCL5 and CXCL10 were detected by immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. The bacteria in colonic contents was sequenced, annotated and clustered by using the V3—V4 variable region of 16S rRNA. The Alpha diversity, Beta diversity, and the species difference among groups were analyzed by linear discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe. Redundancy analysis and Spearman’s rank correlation coefficient were used for correlation analysis between intestinal flora and CCL5, CXCL10.Compared with the normal group, the weight of mice in the model control group was decreased (< 0.01), the inflammatory cell infiltration in the lamina propria of intestinal mucosa was obvious and the expression of CCL5 and CXCL10 was upregulated (< 0.01), the levels of CCL5 and CXCL10 in the colon tissue were both increased (< 0.01) after 3 d treatment. Compared with the model control group, the weight of mice was increased in each treatment group. Inflammatory cell infiltration, CCL5 and CXCL10 positive cells, the contents of CCL5 and CXCL10 in intestinal mucosa were all decreased, especially in oseltamivir group and MXSGD group (< 0.01,< 0.05). There were significant differences in the composition of the gut microbiota among groups according to the analysis of flora diversity and the species differences. The composition of intestinal flora in the model control group was significantly different from the normal control group and each drug group. The relative abundances of Proteobacteria andin the model control group were significantly higher than the normal control group (< 0.05), while Firmicutes,andwere significantly lower (< 0.05). Compared with the model control group, the relative abundances of Proteobacteria andin each drug group were significantly lower (< 0.05), the relative abundance of Firmicutes in oseltamivir group and MXSGD group were increased significantly (< 0.01), the relative abundance ofin antiviral granule group was increased (< 0.05), and the relative abundance ofandin MXSGD group was increased significantly (< 0.01,< 0.05). After 7 d, pathological changes of colon tissue, the expression of chemokines and the abundance of Proteobacteria andspecies (< 0.01) in the model control group were all decreased. Compared with the model control group, the relative abundances of Verrucomicrobia in each drug group were significantly lower (< 0.01,< 0.05) and the relative abundance of Bacteroidetes were increased significantly (< 0.05). Correlation analysis showed that CCL5 and CXCL10 contents in the colon of mice were significantly correlated with the abundance of,,and(< 0.01,< 0.05).The infection of influenza A virus can make the intestinal flora structure disorganized and immune function in mice unbalanced. MXSGD may regulate the intestinal flora structure and then affect the production of chemokines, which has a certain protective effect on the intestinal immune damage caused by influenza virus.

influenza A virus (IAV); Maxing Shigan Decoction; intestinal flora; chemokines; CCL5; CXCL10

R285

A

0253 - 2670(2021)01 - 0160 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.020

2020-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774126）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074250）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020JJ4063）；湖南省教育廳創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金項(xiàng)目（17K067）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科開(kāi)放基金（2018ZXYJH11）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題立項(xiàng)項(xiàng)目（2019CX05）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題立項(xiàng)項(xiàng)目（2019CX22）；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)（黔科合平臺(tái)人才 [2020] 5010）

王 平（1977—），女，貴州畢節(jié)人，副教授，湖南中醫(yī)藥大學(xué)在讀博士，研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉闹嗅t(yī)藥防治研究。

盧芳國(guó)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉闹嗅t(yī)藥防治研究。E-mail: lufangguo0731@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]