周燕子，王敏存，賀玉婷，李海英，陳定芳，潘 雪，周逸群*，賀福元, 3*

魚腥草揮發(fā)油體外代謝通用客體“印跡模板”研究

周燕子1, 2，王敏存1, 2，賀玉婷1, 2，李海英1, 2，陳定芳1, 2，潘 雪1, 2，周逸群1, 2*，賀福元1, 2, 3*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥超分子機(jī)理與數(shù)理特征化實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

基于體外代謝模型對(duì)魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物通用客體“印跡模板”進(jìn)行研究。自制魚腥草注射液（Houttuyniae Injection，HI），將其在大鼠肝微粒（RLM）中進(jìn)行孵育，于不同時(shí)間點(diǎn)采集樣本，進(jìn)行GC-MS測(cè)定；計(jì)算所有代謝產(chǎn)物的分子連接性指數(shù)（MCI），并從中篩選出代謝產(chǎn)物的共有成分和非共有成分，總結(jié)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，運(yùn)用夾角余弦法計(jì)算相似度；將所有代謝成分進(jìn)行歸類。共得到魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物62個(gè)，其中共有成分6個(gè)，分別是十四烷、植烷、正癸酸、己酸、乙酸異龍腦酯和正己醇，除乙酸異龍腦酯外，MCI與總體代謝產(chǎn)物相似度較高（0.914～0.964）。將非共有成分歸類得到6個(gè)成分群，其平均MCI與總代謝產(chǎn)物MCI的相似度均較高（0.939～0.999），然而各個(gè)成分群之間的平均MCI相似度差異顯著。以超分子“印跡模板”為理論指導(dǎo)，為魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物進(jìn)行了歸類。采用分子連接性指數(shù)和夾角余弦法，表征了魚腥草揮發(fā)油代謝通用客體“印跡模板”。

魚腥草揮發(fā)油；代謝產(chǎn)物；超分子；印跡模板；分子連接性指數(shù)；GC-MS；體外代謝；通用客體；魚腥草注射液

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫(yī)別錄》。作為廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕的功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類、黃酮類、有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸以及生物堿類成分[1]。其中揮發(fā)油類成分為主要藥效成分，其鮮草含揮發(fā)油0.049%，主要有魚腥草素，即癸酰乙醛、癸醛、月桂醛及甲基正壬酮等成分[2-6]。

臨床上曾廣泛應(yīng)用的魚腥草注射液（Houttuyniae Injection，HI）是從鮮魚腥草中用水蒸汽蒸餾法提取的揮發(fā)油類成分[7]，加入增溶劑聚山梨酯-80及氯化鈉調(diào)節(jié)為等滲溶液，濾過后滅菌而成，具有抗菌、抗病毒以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥理作用，用于治療上呼吸道感染、急性化膿性扁桃體炎、急性慢性支氣管炎、肺炎等呼吸道疾病、尿道炎、腎盂腎炎等泌尿系統(tǒng)疾病以及各種皮膚感染等疾病[8?10]。魚腥草的有效成分為揮發(fā)油，是多成分體系[11?13]。目前，關(guān)于魚腥草揮發(fā)油的代謝產(chǎn)物鮮有報(bào)道，且沒有將這些代謝產(chǎn)物進(jìn)行歸類總結(jié)。

超分子化學(xué)，即“超越分子的化學(xué)”，由J M Lehn提出，是分子間鍵的化學(xué)，涵蓋由兩個(gè)或兩個(gè)以上化學(xué)成分締合形成的實(shí)體的結(jié)構(gòu)和功能，用于研究分子自識(shí)別、自組裝等現(xiàn)象[14]。中藥超分子化學(xué)理論認(rèn)為，中藥與人體均為自然界生物超分子體，其藥效基礎(chǔ)為生物超分子“印跡模板”的聚集體，進(jìn)入人體后按超分子自主印跡行為發(fā)揮藥效作用[15]，代謝產(chǎn)物也同樣適用[16]?！坝≯E模板”理念起源于Fischer的酶與底物作用的“鎖鑰模型”及Pauling的“抗體-抗原”學(xué)說(shuō)，可解釋配體-受體理論，屬超分子化學(xué)中主-客體化學(xué)研究范疇，具自組裝、自組織、自識(shí)別與自復(fù)制的特點(diǎn)[17]?！霸诳臻g結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上能完全匹配的模板物”即為超分子“印跡模板”，對(duì)中藥成分來(lái)說(shuō)既是其分子結(jié)構(gòu)的空間活性結(jié)構(gòu)，也可以說(shuō)是活性原子團(tuán)的空間排列點(diǎn)陣，據(jù)此可從化學(xué)物質(zhì)的本源上闡明主-客體分子自主作用的普遍規(guī)律。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過自制HI，首次研究HI中的揮發(fā)油在大鼠肝微粒體的代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn)，以超分子“印跡模板”為理論[16,18?20]，結(jié)合分子連接性指數(shù)（MCI）[21]，探索其代謝通用客體的“印跡模板”規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)魚腥草臨床合理用藥及其配伍具有重要意義，為中藥代謝產(chǎn)物“印跡模板”的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

新鮮魚腥草8批，購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)含浦校區(qū)周邊村莊或菜市場(chǎng)，按照采購(gòu)時(shí)間批次編號(hào)依次為YXC01～YXC08，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為三白草科蕺菜屬植物蕺菜Thunb.的新鮮全草。

對(duì)照品甲基正壬酮（批號(hào)110834-200502，0.1 mL，GC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、正十五烷（批號(hào)11677-200401，100 μg/mL）、乙酸龍腦酯（批號(hào)110759-201105，0.2 mL，GC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）及α-蒎烯（批號(hào)897-2000001，1 mg，GC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；正已烷，批號(hào)K46764991524，色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克股份有限公司；KH2PO4、K2HPO4、KCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、甘油、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P-DH）、MgCl2、(NH4)2SO4均購(gòu)自Sigma公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。本研究依照湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的要求執(zhí)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：LLBH- 201107230003）。

1.3 儀器

CM-230超純水系統(tǒng)，北京帕思特科技有限公司；GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；CP-114電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；98-1-B型電子控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；1000 μL和100 μL移液槍，濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司；20 mm球形冷凝管，天津市奧淇洛譜商貿(mào)有限公司；500 mL揮發(fā)油提取器，天長(zhǎng)市吉高實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 HI樣品制備

取新鮮魚腥草全株，除去泥沙、根及爛葉，稱取2000 g，用剪刀剪碎成2～3 cm的小段，置于單口圓底燒瓶中加水浸沒藥材。水蒸氣蒸餾，收集初次蒸餾液2000 mL，再進(jìn)行重蒸餾，收集重蒸餾液約1000 mL，加入7 g氯化鈉及5 g聚山梨酯-80，混勻，加注射用水使成1000 mL，使用0.45 μm和0.22 μm的濾芯進(jìn)行濾過，灌封，115 ℃滅菌30 min，即得HI。

2.2 肝微粒體實(shí)驗(yàn)溶液配制

2.2.1 PBS液配制 精密稱取KH2PO4、K2HPO4、KCl粉末分別配制成1 mol/L的溶液，并配制EDTA飽和溶液（100 mmol/L），用移液管量取40.1 mL K2HPO4溶液，9.9 mL KH2PO4溶液，60 mL KCl溶液，5 mL EDTA溶液，加水至500 mL，調(diào)整pH值為7.4，即得PBS液。

2.2.2 G.S（800 mL）系統(tǒng)溶液的配制 將NADP、G-6-P、G-6-P-DH、MgCl2、(NH4)2SO4分別配制成65 mmol/L、165 mmol/L、500 U/mL、165 mmol/L、2.6 mol/L的溶液，向離心管中分別加入去離子水528 μL，G-6-P溶液80 μL，G-6-P-DH溶液32 μL，NADP溶液80 μL，MgCl2溶液80 μL，配制成G.S（800 mL）系統(tǒng)溶液。

2.3 大鼠肝微粒體制備

實(shí)驗(yàn)前大鼠控制飲食1周，并于實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h。將大鼠固定在木板上，并用細(xì)線把大鼠四肢及頭部固定。用剪刀將大鼠腹部打開，快速找到肝臟；用另一把消毒冷藏過的剪刀將肝臟整個(gè)剪下來(lái)，不能帶有除肝臟外的其它任何部分，用冰水洗凈，稱定質(zhì)量。按1∶4比例（1 g肝組織、4 mL PBS液）將肝組織研碎，倒入50 mL離心管，以9000×、4 ℃離心20 min后快速取上清，再以恒溫4 ℃、100 000×離心90 min，取下層粉紅色沉淀，即為大鼠肝微粒體，按照體積比1∶3向肝微粒體中加入儲(chǔ)存液（750 mL PBS，250 mL甘油）后，分裝于離心管中?80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 孵化反應(yīng)

向管中加入25 μL HI（空白組加蒸餾水），40 μL的磷酸鹽緩沖液（pH值7.4），20 μL肝微粒體和60 μL雙蒸餾水，37 ℃恒溫水浴鍋預(yù)孵化10 min。加入G.S液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，并繼續(xù)在37 ℃孵育，于10、30、45、60、75、90、120、150 min取樣品。平行3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 體外代謝樣品的制備

在樣品中加入22.0 μg/mL正十五烷（內(nèi)標(biāo)），用800 μL氯仿-異丙醇（9∶1）萃取，渦旋振蕩1 min，3000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行GC-MS測(cè)定。

2.6 GC-MS分析條件

2.6.1 氣相色譜條件 色譜柱為石英毛細(xì)管柱Rtx-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初溫為60 ℃，以2 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持9 min；分流比30∶1；載氣為高純He（99.999%）；載氣流量為1.0 mL/min；氣化室溫度為250 ℃。

2.6.2 質(zhì)譜條件 離子源為EI源；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；接口溫度為280 ℃；溶劑延遲2.5 min；質(zhì)量范圍為/40～500。

3 結(jié)果

3.1 魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物信息

根據(jù)GC-MS結(jié)果，只采用2組理想的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行展示并分析。扣除空白溶劑峰，整理得到每個(gè)時(shí)間段各個(gè)峰的峰面積以及頻數(shù)，共得到魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物62個(gè)，結(jié)果見表1，其中S1、S2來(lái)自YXC01，S3、S4來(lái)自YXC02，S5、S6來(lái)自YXC03，S7、S8來(lái)自YXC04，S9、S10來(lái)自YXC05，S11、S12來(lái)自YXC06，S13、S14來(lái)自YXC07，S15、S16來(lái)自YXC08。

3.2 魚腥草揮發(fā)油代謝共有產(chǎn)物

將頻數(shù)≥15（90%批次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)批次數(shù)為16）的成分視為共有成分，共得到6個(gè)共有成分，按相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)從高到低排序分別為十四烷（7.15%）、植烷（6.65%）、正癸酸（3.10%）、己酸（0.41%）、乙酸異龍腦酯（0.18%）、正己醇（0.13%），且大都為簡(jiǎn)單直鏈結(jié)構(gòu)，由芳香環(huán)、酯類等復(fù)雜的結(jié)構(gòu)經(jīng)過肝微粒酶代謝轉(zhuǎn)化而來(lái)。由表2可得，共有成分的保留時(shí)間分布大致均勻。本實(shí)驗(yàn)只展示MCI零階、一階和二階的值。采用夾角余弦法計(jì)算相似度，得到共有成分的MCI與總代謝產(chǎn)物相似度普遍較高，可以代表魚腥草揮發(fā)油總代謝產(chǎn)物的“印跡模板”。乙酸異龍腦酯的相似度較低，可能是由于乙酸異龍腦酯具有較復(fù)雜的帶環(huán)立體結(jié)構(gòu)，觀察各個(gè)成分結(jié)構(gòu)可知，大致包含烷烴、醇類、酯類、醛酮類等成分，且結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。眾所周知，MCI值與分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)，分子結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，會(huì)在MCI各階出現(xiàn)相應(yīng)的變化，這可能是導(dǎo)致乙酸異龍腦酯MCI相似度較低的原因。

表1 各組魚腥草揮發(fā)油代謝產(chǎn)物的峰面積及頻數(shù)

續(xù)表1

編號(hào)tR/min峰面積頻數(shù)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S164129.242147 0560269 38115 143 2530619 012000000304 4760171 0810 64229.642823 180257 4102 631 45031 385 948000969 690071 038189 771712 808197 20385 08600104331.2426 782 1263 050 5384 566 61376 209 750706 0154 088 110015 355 377724 2122 781 7423 609 3404 231 8781 823 9883 222 7431 237 9971 323 433154431.642522 86408 177 3710625 72804 367 74630 790 6342 325 9355 358 9104 219 42102 454 4524 410 6332 278 2573 192 034124532.0427 124 6171 637 4063 024 53703 292 51713 868 02212 738 63427 412 5650488 3745 286 43703 321 8384 327 42447 04745 298134632.8422 128 340431 3125 583 758202 312 7034 205 0519 691 520043 086 5341 487 725355 6561 021 72612 585 6814 364 4337 851 8302 796 0341 466 327154733.2421 225 79770 0403 118 86201 238 5542 764 3431 266 07846 507 14312 177 684896 1673 898 292003 202 649656 344531 384134833.642298 647106 909807 090001 911 733630 23941 174 83616 835 093431 6781 892 1112 364 2711 908 99200192 932124934.042304 65161 131852 348000600 00855 418 93523 411 865002 313 7501 279 3302 112 507400 28260 571115034.842366 89857 4951 130 8870000104 253 61243 907 50400932 52200044 357 75135.6421 326 123100 9474 608 82600268 1581 068 84883 013 06842 500 233654 8892 334 305618 77218 718 216556 044200 0980135236.0425 150 505795 10218 030 606001 427 066433 34556 652 99884 425 233250 151817 2061 813 49841 899 0291 192 12900125336.442987 566239 7675 237 69901 929 2316 797 2673 303 876124 623 44287 084 3942 682 97810 504 098727 81931 524 892978 5141 334 949603 473155436.8423 640 215143 6350893 962 6107 145 66601 159 07856 845 49858 655 234642 1953 470 8686 094 001121 897 6445 720 950770 615216 404145537.6421 050 463342 8293 920 01500823 245379 119165 268 62498 446 60486 75902 860 9834 077 0353 374 78638 9330125638.0422 060 478364 7335 775 607001 461 4861 382 774136 577 372128 137 289536 1433 533 7861 056 30501 588 977221 089154 570135740.8421 465 773535 8868 732 611001 393 0331 574 455001 432 9765 410 457000135 299677 329 95841.242072 4320453 116604 9603 721 5121 069 264001 283 2157 734 5062 007 08803 585 6880865 634105941.6423 248 15848 13218 068 28400000001 965 9161 483 664764 9142 687 221497 2431 336 963 96042.042716 160123 8943 324 3510636 8922 764 5751 668 437004 017 42010 793 550272 416700 0562 577 210353 1763 310 469136144.442256 58902 821 955001 509 880154 552000902 6133 534 5640711 032145 870137 757 96244.84200000524 8750000100 57700286 95900 3