李佳妍，劉欣欣，寧 青，李彥東，石子琪，韋英杰*

基于斑馬魚(yú)模型的補(bǔ)骨脂毒性相關(guān)成分群的高效辨識(shí)研究

李佳妍1, 2，劉欣欣1, 2，寧 青1, 2，李彥東2，石子琪1, 2，韋英杰1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210028

基于斑馬魚(yú)模型結(jié)合相關(guān)分析高效辨識(shí)補(bǔ)骨脂毒性成分群。采用高效液相色譜法測(cè)定7個(gè)產(chǎn)地18個(gè)批次補(bǔ)骨脂中4個(gè)香豆素類、4個(gè)黃酮類和補(bǔ)骨脂酚的含量。以斑馬魚(yú)（6 dpf）死亡率、臟器中毒形態(tài)、半數(shù)致死濃度（lethal concentration 50，LC50）值為指標(biāo)，采用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)18個(gè)批次補(bǔ)骨脂水煎液的毒性。將各類成分的含量分別與斑馬魚(yú)LC50值進(jìn)行相關(guān)分析，辨識(shí)毒性成分群，并通過(guò)對(duì)代表成分的斑馬魚(yú)毒性評(píng)價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證。不同產(chǎn)地18個(gè)批次補(bǔ)骨脂水煎液中香豆素類、黃酮類、補(bǔ)骨脂酚的含量差異較大，4個(gè)香豆素類成分、黃酮成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮）和補(bǔ)骨脂酚含量最大值分別是最小值的3.47～5.60、5.30、6.47倍。斑馬魚(yú)毒性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示18個(gè)批次補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)毒性差異較大，其中LC50最大值是最小值的7.2倍。毒性與成分含量相關(guān)分析結(jié)果表明，斑馬魚(yú)毒性與黃酮類成分、補(bǔ)骨脂酚的相關(guān)性較好（2分別為0.623 4、0.587 8），與香豆素類成分的相關(guān)性較低（2為0.187 7）。各類代表成分的毒性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂酚和3個(gè)黃酮成分（補(bǔ)骨脂甲素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂乙素）是補(bǔ)骨脂致毒的關(guān)鍵成分，香豆素類成分的安全性相對(duì)較好。斑馬魚(yú)模型可高效、靈敏反映不同批次補(bǔ)骨脂毒性的差異，通過(guò)毒性與成分含量的相關(guān)分析，能夠快速發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂中毒性相關(guān)成分群，為從中藥復(fù)雜體系快速發(fā)現(xiàn)毒性及其相關(guān)物質(zhì)提供依據(jù)。

補(bǔ)骨脂；毒性成分；斑馬魚(yú)；相關(guān)分析；補(bǔ)骨脂甲素；新補(bǔ)骨脂異黃酮；補(bǔ)骨脂乙素

近年來(lái)，補(bǔ)骨脂及其復(fù)方的肝毒性作用受到廣泛關(guān)注[1-2]。國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，服用含補(bǔ)骨脂的仙靈骨葆口服制劑具有肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，患者臨床表現(xiàn)為乏力、食欲不振、惡心、上腹脹痛、尿黃、目黃、皮膚黃染等，并伴有谷丙酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素等升高，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肝衰竭。補(bǔ)骨脂可能會(huì)導(dǎo)致膽汁瘀積性肝損傷，Wang等[3]研究表明補(bǔ)骨脂可能通過(guò)抑制7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、膽鹽輸出泵（bile saltexport pump，BSEP）、細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）等膽汁運(yùn)輸相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)大鼠膽汁瘀積性肝損傷。補(bǔ)骨脂化學(xué)成分復(fù)雜，目前已從中分離并鑒定出117個(gè)化合物，包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類、苯并呋喃類等[4-5]?，F(xiàn)有研究?jī)H報(bào)道了補(bǔ)骨脂少數(shù)成分（如補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂酚等）具有明顯的肝腎毒性[6-9]，而其他成分的安全性尚不明確。因此，如何從復(fù)雜體系中快速辨識(shí)毒性相關(guān)成分是重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。

傳統(tǒng)方法常用化學(xué)分離結(jié)合毒性評(píng)價(jià)追蹤毒性成分?；瘜W(xué)分離純化成分耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、工作強(qiáng)度大，且獲得的化合物量少，常不能滿足評(píng)價(jià)?，F(xiàn)有的毒性評(píng)價(jià)模型如哺乳動(dòng)物模型不能進(jìn)行規(guī)?；Y選，具耗時(shí)長(zhǎng)、工作強(qiáng)度大、樣品用量大等缺點(diǎn)；體外細(xì)胞模型作用環(huán)節(jié)相對(duì)單一，不能體現(xiàn)在體實(shí)驗(yàn)的綜合效果[10-11]。因此，不需進(jìn)行化學(xué)成分分離，且能夠在體高效快速鎖定毒性目標(biāo)成分群尤為重要。斑馬魚(yú)是一種小型熱帶脊椎動(dòng)物，其基因組與人類基因組的同源性約為87%。斑馬魚(yú)發(fā)育快、個(gè)體小、繁殖多、胚胎透明、實(shí)驗(yàn)周期短，可在微板中實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察藥物的毒性作用[12-15]，是近年來(lái)高效篩選藥物毒性的理想模式動(dòng)物模型[12,16]。本研究以補(bǔ)骨脂為對(duì)象，采用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)7個(gè)產(chǎn)地18批補(bǔ)骨脂的毒性，并采用HPLC法測(cè)定補(bǔ)骨脂中香豆素類、黃酮類、補(bǔ)骨脂酚含量，進(jìn)一步分析其毒性與成分的相關(guān)性，從而鎖定補(bǔ)骨脂毒性相關(guān)成分群，通過(guò)對(duì)代表成分的毒性評(píng)價(jià)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

野生型（Tuebigen系后代）斑馬魚(yú)，6月齡，購(gòu)于南京堯順禹生物科技有限公司。成魚(yú)在（28.0±0.5）℃的水中自由交配繁殖魚(yú)卵，養(yǎng)殖與繁殖方法參照文獻(xiàn)方法[17]。

1.2 藥材

補(bǔ)骨脂購(gòu)自不同藥店或飲片公司（表1），經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院韋英杰研究員鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂L. 的干燥成熟果實(shí)。

表1 補(bǔ)骨脂樣品信息

1.3 藥品與試劑

補(bǔ)骨脂素（psoralen，批號(hào)110739-201617）、異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen，IPS，批號(hào)110738-201614）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.7%；補(bǔ)骨脂苷（psoralenoside，批號(hào)180526）、異補(bǔ)骨脂苷（isopsoralenoside，IPSS，批號(hào)180524）對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；新補(bǔ)骨脂異黃酮（neobavaisoflavone，NBIF，批號(hào)DST170522-055）、4′--甲基補(bǔ)骨脂查耳酮（4′--methylbrousso chalcone，BCC，批號(hào)DST170522-052）、corylifol A（CA，批號(hào)DST170522-073）對(duì)照品購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；補(bǔ)骨脂甲素（bavachin，BC，又名補(bǔ)骨脂二氫黃酮，批號(hào)JZ17031802）、補(bǔ)骨脂乙素（isobavachalcone，IBCC，又名異補(bǔ)骨脂查耳酮，批號(hào)JZ1703180）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（bavachinin A，BCin，批號(hào)JZ16071904）、補(bǔ)骨脂定（psoralidin，批號(hào)JZ16110406）、補(bǔ)骨脂寧（corylin，又名補(bǔ)骨脂異黃酮，批號(hào)JZ16091204）、補(bǔ)骨脂酚（bakuchiol，批號(hào)JZ16092103）對(duì)照品購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；甲醇（批號(hào)19085170，色譜純）、乙腈（批號(hào)19015157，色譜純）購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；甲酸（批號(hào)G1826012，色譜純）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

ECLIPSE E100顯微鏡（日本Nikon公司）；Stylus TG-4相機(jī)（日本Olympus公司）；生化培養(yǎng)箱SPX-80（寧波海曙賽褔實(shí)驗(yàn)儀器廠）；1260型系列高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ3200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法

2.1 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂中香豆素類、黃酮類成分、補(bǔ)骨脂酚的HPLC分析

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，B為乙腈，梯度洗脫：0 min，90% A；0～30 min，90%～50% A；30～45 min，50%～40% A；45～55 min，40%～20% A；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；運(yùn)行時(shí)間55 min；進(jìn)樣量10 μL。分析不同產(chǎn)地18個(gè)批次補(bǔ)骨脂的4個(gè)代表香豆素成分補(bǔ)骨脂苷、IPSS、補(bǔ)骨脂素、IPS；4個(gè)代表黃酮成分NBIF、BC、BCin、CA和單萜酚補(bǔ)骨脂酚的含量。

2.1.2 對(duì)照品溶液配制與線性關(guān)系考察 取補(bǔ)骨脂苷、IPSS、補(bǔ)骨脂素、IPS、NBIF、BC、BCin、CA、補(bǔ)骨脂酚適量，精密稱定，加80%甲醇或甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為406.26、200.00、95.00、216.00、192.60、243.20、214.52、291.52、600.00 μg/mL的溶液，采用2倍稀釋法分別進(jìn)行稀釋，進(jìn)樣分析，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，各成分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 9種成分的回歸方程

2.1.3 供試品溶液配制與測(cè)定 稱取不同產(chǎn)地的補(bǔ)骨脂10 g，分別加10倍量水煎煮2次，每次0.5 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液加純水至200 mL，調(diào)整至藥材質(zhì)量濃度為50 mg/mL。取400 μL溶液，干燥得到補(bǔ)骨脂水煎液干粉（相當(dāng)于20 mg生藥）。取補(bǔ)骨脂水煎液干粉適量，置2 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2 基于斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂的安全性

2.2.1 藥物配制 取補(bǔ)骨脂水煎液干粉，用培養(yǎng)基配制成不同質(zhì)量濃度（50、100、300、500、750、1000 μg/mL）的溶液。

2.2.2 分組與給藥 培養(yǎng)基由5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4組成。斑馬魚(yú)胚胎由斑馬魚(yú)成魚(yú)自然交配產(chǎn)生，將胚胎放置培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取受精后（days post fertilization，dpf）1 d的斑馬魚(yú)健康胚胎置24孔板中，8個(gè)/孔，16個(gè)/組，設(shè)置對(duì)照組和補(bǔ)骨脂（50、100、300、500、750、1000 μg/mL）組。對(duì)照組加入2 mL培養(yǎng)基，給藥組加入2 mL不同質(zhì)量濃度的補(bǔ)骨脂溶液。每天計(jì)數(shù)斑馬魚(yú)死亡數(shù)量，死亡的斑馬魚(yú)及時(shí)撈出并記錄，于顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)的形態(tài)，于3～6 dpf拍照。

2.2.3 毒性與成分含量關(guān)聯(lián)的相關(guān)分析 采用SPSS 16.0軟件計(jì)算6 dpf斑馬魚(yú)半數(shù)死亡濃度（lethal concentration 50，LC50）。將不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂的LC50值與其香豆素類、黃酮類、補(bǔ)骨脂酚含量進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2.2.4 相關(guān)分析辨識(shí)毒性成分群的安全性驗(yàn)證采用斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)4個(gè)香豆素類、7個(gè)黃酮類成分、PD、補(bǔ)骨脂酚的安全性，并與相關(guān)分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液中代表性成分的含量分析

采用HPLC法分析補(bǔ)骨脂水煎液中補(bǔ)骨脂苷、IPSS、補(bǔ)骨脂素、IPS、NBIF、BC、BCin、CA、補(bǔ)骨脂酚，如圖1所示。用外標(biāo)法計(jì)算不同產(chǎn)地共18批補(bǔ)骨脂水煎液中各成分的含量及平均值，以各成分含量均值占總和的百分比作為各成分的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表3，補(bǔ)骨脂水煎液以香豆素類成分為主，4個(gè)成分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為91.32%，其中補(bǔ)骨脂苷、IPSS、補(bǔ)骨脂素、IPS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.36～25.58、4.76～21.25、0.65～3.51、0.41～2.32 mg/g，不同產(chǎn)地批次質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，最大值是最小值的3.47～5.60倍；補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之（0.68～4.40 mg/g），平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.36%，不同產(chǎn)地批次最大值是最小值的6.47倍；黃酮類成分最少，NBIF、BC、BCin、CA的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為2.33%，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.16～0.84、0～0.47、0～0.36、0 mg/g。

1-補(bǔ)骨脂苷 2-IPSS 3-補(bǔ)骨脂素 4-IPS 5-NBIF 6-BC 7-BCin 8-CA 9-補(bǔ)骨脂酚

表3 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液代表成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3.2 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)胚胎/幼魚(yú)毒性的影響

3.2.1 斑馬魚(yú)形態(tài)檢視結(jié)果 斑馬魚(yú)受精3 dpf后孵化成幼魚(yú)，各臟器發(fā)育基本完全，魚(yú)體透明，在載玻片上易側(cè)臥，顯微鏡下檢視臟器形態(tài)清楚、直觀。將3 dpf斑馬魚(yú)胚胎或幼魚(yú)進(jìn)行顯微鏡檢視并拍照，結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，18批補(bǔ)骨脂給藥組呈現(xiàn)不同程度的臟器中毒現(xiàn)象。其中，輕度中毒的斑馬魚(yú)表現(xiàn)出心胞及卵黃囊微腫大的現(xiàn)象；中度中毒的斑馬魚(yú)出現(xiàn)心胞腫大伴隨充血、卵黃囊腫大伴隨發(fā)黑、且身體出現(xiàn)微彎曲等畸形特征；重度中毒的斑馬魚(yú)畸形程度更加明顯，一般會(huì)出現(xiàn)脊柱、尾部彎曲，色素沉淀減小，心率不穩(wěn)，眼睛變小，身體變短；少數(shù)高劑量組還表現(xiàn)出幼魚(yú)出膜晚或不出膜等現(xiàn)象。

藍(lán)色箭頭：心胞；紅色箭頭：卵黃囊；標(biāo)尺：1 mm

由表4可知，補(bǔ)骨脂水煎液致斑馬魚(yú)幼魚(yú)的中毒質(zhì)量濃度為50～1000 μg/mL。不同產(chǎn)地、批次的補(bǔ)骨脂致斑馬魚(yú)中毒的質(zhì)量濃度不同，毒性差異較大（HB組致斑馬魚(yú)中毒的質(zhì)量濃度約為JK、YN5、JS1組的20倍）。JK、YN5、JS1、YN4組致斑馬魚(yú)中毒的質(zhì)量濃度為50～100 μg/mL，毒性較大；JS2、AH2、YN6、YN10、YN3、YN1、YN8、AH1組致斑馬魚(yú)中毒的質(zhì)量濃度為300～500 μg/mL，毒性次之；HN、SC、YN7、YN2、YN9、HB致斑馬魚(yú)中毒的質(zhì)量濃度為750～1000 μg/mL，毒性較小。

表4 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)(3 dpf) 的畸形特征和中毒質(zhì)量濃度的影響

A：卵黃囊腫脹及發(fā)黑 B：心胞腫大 C：心胞充血 D：脊柱、尾部彎曲 E：眼睛及身體變淺 F：眼睛變小 G：出現(xiàn)未孵化現(xiàn)象 H：身體變短

A: Swelling and darkening of the yolk sac B: Enlarged heart C: Congestive pericardium D: Spine and tail bending E: Reduced pigmentation F: Eyes become smaller G: Embryos appear unhatched H: Zebrafish body shortened

3.2.2 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)死亡率的影響 如圖3所示，斑馬魚(yú)的死亡率與補(bǔ)骨脂質(zhì)量濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。死亡率小于20%的藥物濃度為安全濃度[18]，根據(jù)死亡率曲線，計(jì)算出斑馬魚(yú)死亡率達(dá)20%時(shí)各批次的補(bǔ)骨脂質(zhì)量濃度（LC20），如圖4所示，補(bǔ)骨脂LC20（μg/mL）由小到大依次為136.9（YN5）、158.3（YN10）、241.5（AH2）、246.5（YN1）、279.0（YN6）、315.6（YN3）、318.9（YN7）、328.0（AH1）、336.9（JS2）、367.2（JK）、383.8（JS1）、479.0（HN）、481.6（YN8）、504.1（YN4）、541.5（HB）、638.3（SC）、694.2（YN9）、774.7（YN2）。表明不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同批次的補(bǔ)骨脂對(duì)斑馬魚(yú)安全用藥的質(zhì)量濃度差異較大，最大值（YN2）是最小值（YN5）的5.7倍。

圖3 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)(2～6 dpf) 死亡率的影響

圖4 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)(6 dpf)的LC20

3.2.3 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂對(duì)斑馬魚(yú)的LC50補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)（6 dpf）的LC50越小，其致魚(yú)中毒的藥物質(zhì)量濃度越低、毒性越大。如圖5所示，不同產(chǎn)地、批次補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)（6 dpf）LC50差異較大（173.2～1 242.0 μg/mL），最大值（YN2）是最小值（YN5）的7.2倍，且同為云南產(chǎn)地。表明不同產(chǎn)地和同為云南產(chǎn)地不同批次的補(bǔ)骨脂致魚(yú)毒性差異較大。5個(gè)批次（YN5、YN10、AH2、YN1、YN6）的LC50值均小于400 μg/mL，毒性較大；7個(gè)批次（JS1、AH1、JS2、YN7、YN3、HN、JK）的LC50值為400～600 μg/mL，毒性次之；6個(gè)批次（HB、YN8、YN4、YN9、SC、YN2）的LC50值為600～1000 μg/mL，毒性較小，與上述LC20結(jié)果一致。

圖5 不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)斑馬魚(yú)(6 dpf)的LC50

3.2.4 補(bǔ)骨脂水煎液毒性與其成分含量的相關(guān)分析辨識(shí)毒性成分群的結(jié)果 分別將18個(gè)批次補(bǔ)骨脂水煎液中香豆素類成分含量（4個(gè)香豆素代表成分含量之和）、黃酮類成分含量（3個(gè)黃酮代表成分含量之和）、補(bǔ)骨脂酚含量與斑馬魚(yú)（6 dpf）的LC50值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如圖6所示，黃酮類成分、補(bǔ)骨脂酚與斑馬魚(yú)毒性相關(guān)性較好（R分別為0.623 4、0.587 8）；香豆素類成分的相關(guān)性相對(duì)較差（2＝0.187 7），提示補(bǔ)骨脂水煎液中的毒性可能主要由黃酮類成分和補(bǔ)骨脂酚引起。

圖6 不同產(chǎn)地、批次補(bǔ)骨脂水煎液中各類成分含量與斑馬魚(yú)毒性的相關(guān)性分析

3.2.5 補(bǔ)骨脂藥材中香豆素類代表成分、黃酮類代表成分和補(bǔ)骨脂酚對(duì)斑馬魚(yú)的毒性結(jié)果 基于斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂藥材中4個(gè)主要香豆素成分、7個(gè)黃酮成分、內(nèi)酯類補(bǔ)骨脂定和單萜酚補(bǔ)骨脂酚的安全性，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0計(jì)算斑馬魚(yú)（6 dpf）LC50值，參考斑馬魚(yú)毒性評(píng)價(jià)量表[18]，結(jié)果如圖7所示，LC50值最小即毒性最大的補(bǔ)骨脂酚為高毒成分，其LC50值為0.74 μg/mL，在0.1～1.0 μg/mL；3個(gè)黃酮成分BC、NBIF、IBCC的LC50值在1～10 μg/mL，是中等毒性物質(zhì)；其他黃酮類成分如BCin、BCC，香豆素類成分如IPS、補(bǔ)骨脂素，毒性次之，LC50值為補(bǔ)骨脂酚的22～39倍，在10～100 μg/mL，是輕微毒性物質(zhì)；補(bǔ)骨脂香豆素糖苷（補(bǔ)骨脂苷、IPSS）、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂寧、CA安全性最好，LC50值大于100 μg/mL，為補(bǔ)骨脂酚的130～185倍，為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。表明補(bǔ)骨脂酚和3個(gè)主要黃酮（BC、NBIF、IBCC）是補(bǔ)骨脂致毒的關(guān)鍵成分，香豆素及其糖苷類成分安全性相對(duì)較好，與上述相關(guān)分析結(jié)論一致。

圖7 補(bǔ)骨脂藥材中13個(gè)成分對(duì)斑馬魚(yú)(6 dpf)的LC50

4 討論

本研究針對(duì)中藥復(fù)雜體系毒性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的難點(diǎn)問(wèn)題，通過(guò)斑馬魚(yú)高效評(píng)價(jià)毒性與成分含量進(jìn)行相關(guān)分析，以高效辨識(shí)毒性成分群，從而克服傳統(tǒng)化學(xué)分離先導(dǎo)的毒性追蹤低效、高成本的缺陷。斑馬幼魚(yú)毒性評(píng)價(jià)在24孔板中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)周期為6 d，溶液暴露的給藥方式簡(jiǎn)單易行，可批量進(jìn)行，魚(yú)體透明，臟器形態(tài)變化可在顯微鏡下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察。補(bǔ)骨脂致斑馬魚(yú)（3 dpf）出現(xiàn)卵黃囊吸收延遲、腫大或變黑，提示與肝毒性相關(guān)，與文獻(xiàn)中補(bǔ)骨脂對(duì)人和小鼠造成肝損傷的結(jié)論一致[19-22]；補(bǔ)骨脂致魚(yú)心胞腫大、充血，提示具一定心臟毒性，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。補(bǔ)骨脂可致魚(yú)發(fā)育明顯遲緩，出現(xiàn)頭部較小、體長(zhǎng)較短或出現(xiàn)脊柱與尾部彎曲等畸形特征。魚(yú)死亡率和LC50值可客觀反映毒性大小，結(jié)果表明不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同批次補(bǔ)骨脂的毒性差異較大。補(bǔ)骨脂毒性由大到小即LC50值（173.2～1 242.0 μg/mL）由小到大分別為YN5＞YN10＞AH2＞YN1＞YN6＞JS1＞AH1＞JS2＞YN7＞YN3＞HN＞JK＞HB＞YN8＞YN4＞YN9＞SC＞YN2。

不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同批次補(bǔ)骨脂的香豆素類成分、黃酮類成分、補(bǔ)骨脂酚的含量差異均較大，各類代表成分含量之和的最大值是最小值的3.47～6.47倍。毒性量化指標(biāo)LC50值與成分含量的相關(guān)分析結(jié)果表明，斑馬魚(yú)毒性與黃酮類成分和補(bǔ)骨脂酚呈強(qiáng)相關(guān)（分別為0.789 6、0.766 7），與香豆素類成分呈弱相關(guān)（為0.433 2）。各類代表成分的毒性評(píng)價(jià)結(jié)果與相關(guān)分析一致：補(bǔ)骨脂酚為高毒成分，3個(gè)黃酮成分（BC、NBIF、IBCC）為中等毒性成分，提示這4個(gè)成分是補(bǔ)骨脂致毒的關(guān)鍵成分。本研究中的3個(gè)關(guān)鍵毒性成分（BC、NBIF、補(bǔ)骨脂酚）含量與毒性密切相關(guān)，毒性較大的6個(gè)批次（YN5、YN10、AH2、YN1、YN6、JS1）補(bǔ)骨脂水煎液中BC、NBIF、補(bǔ)骨脂酚及三者含量之和分別為0.17～0.47、0.48～0.84、3.01～4.40、3.87～5.64 mg/g；毒性次之的6個(gè)批次（AH1、JS2、YN7、YN3、HN、JK）補(bǔ)骨脂BC、NBIF、補(bǔ)骨脂酚及三者含量之和降低，分別為0.10～0.29、0.33～0.47、1.05～1.72、1.50～2.39 mg/g；安全性較好的6個(gè)批次（HB、YN8、YN4、YN9、SC、YN2）補(bǔ)骨脂BC、NBIF、補(bǔ)骨脂酚及三者含量之和含量進(jìn)一步降低，分別為0～0.34、0.16～0.47、0.68～2.18、0.84～2.99 mg/g。提示監(jiān)測(cè)關(guān)鍵致毒成分含量可初步推測(cè)補(bǔ)骨脂毒性大小，對(duì)臨床安全、合理用藥具有指導(dǎo)意義。

綜上，斑馬魚(yú)模型可高效評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂毒性，并可進(jìn)行量化分級(jí)，通過(guò)毒性差異與成分差異的相關(guān)分析，實(shí)現(xiàn)快速辨識(shí)補(bǔ)骨脂毒性相關(guān)成分群，突破化學(xué)分離先導(dǎo)的低效、高成本毒性評(píng)價(jià)的制約，為早期快速發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)雜體系的毒性相關(guān)物質(zhì)提供簡(jiǎn)單、高效、低成本方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effective identification of toxic related components ofbased on zebrafish model

LI Jia-yan1, 2, LIU Xin-xin1, 2, NING Qing1, 2, LI Yan-dong2, SHI Zi-qi1, 2, WEI Ying-jie1, 2

1. The Third Clinical School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 2. Key Laboratory of New Drug Delivery System, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

To efficiently identify the toxic component groups of(PF) based on zebrafish model combined with correlation analysis.Contents of four coumarins, four flavonoids and bakuchiol in 18 batches of PF from seven producing areas were determined by HPLC. Zebrafish model was used to evaluate the toxicity of 18 batches of PFdecoction, with mortality, organ poisoning form, and LC50value of zebrafish (6 dpf) as indicators. Correlation analysis between contents of various components and LC50value of zebrafish (6 dpf) were carried out to identify toxicity related components, and the zebrafish toxicity evaluation results of the representative components were verified.Contents of coumarins, flavonoids and bakuchiol in 18 batches of PF decoction from different producing areas were quite different. The maximum content of four coumarins, flavonoid (neobavaisoflavone) and bakuchiol were respectively 3.47—5.60, 5.30 and 6.47 times of the minimum. The zebrafish toxicity evaluation results showed that the toxicity of 18 batches of PF decoction was quite different, and LC50(6 dpf) of the maximum was 7.2 times of the minimum. The results of correlation analysis between toxicity and component content showed that zebrafish toxicity had a good correlation with flavonoids and bakuchiol (2were respectively 0.623 4 and 0.587 8), while the correlation with coumarins was relatively low (2was 0.187 7). Toxicity evaluation results of various representative components showed that bakuchiol and three flavonoids (bavachin, neobavaisoflavone, isobavachalcone) were the key toxic components of PF, while coumarins was relatively safe.Zebrafish model could efficiently and sensitively reflect toxicity differences of different batches of PF, of which toxicity relevant component groups could be efficiently identified through correlation analysis between toxicity and content of components, providing a reference for quickly discovering toxicity and related substances from the complex system of traditional Chinese medicine.

; toxic components; zebrafish; correlation analysis; bavachin; neobavaisoflavone; isobavachalcone

R285.5，R285.53

A

0253 - 2670(2021)01 - 0129 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.016

2020-08-07

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2017ZX09301-056）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573833）；江蘇省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXTDB2017003）

李佳妍，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。Tel: 18851180283 E-mail: ljy945094845@163.com

韋英杰，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制。Tel: (025)52362109 E-mail: wyj970@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]