趙 芳，陳澤麒，李文竹，茍 維，劉 飛，張程益，瞿海斌*

·藥劑與工藝·

基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化丹參川芎嗪注射液水提工藝

趙 芳1，陳澤麒1，李文竹1，茍 維2，劉 飛2，張程益2，瞿海斌1*

1. 浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058 2. 貴州拜特制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550008

在質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念的指導(dǎo)下優(yōu)化丹參川芎嗪注射液（and Ligustrazine Hydrochloride Injection，SMLHI）的水提工藝。首先通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定加熱溫度、保溫時(shí)間、藥材規(guī)格和溶劑倍量為丹參水提工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)。隨后為了提高實(shí)驗(yàn)效率，采用基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化SMLHI的水提工藝。為了盡可能多的提取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)潛在信息，采用了響應(yīng)曲面法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法2種方法建立關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性之間的回歸模型。最后，選擇較優(yōu)的模型進(jìn)一步采用基于滿意度函數(shù)的多指標(biāo)優(yōu)化算法綜合考察提取液各關(guān)鍵質(zhì)量屬性，確定水提工藝的最佳操作條件?；诹褏^(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以有效提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)發(fā)現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型較響應(yīng)曲面法模型具有更好的擬合能力和預(yù)測(cè)能力。以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型為基礎(chǔ)進(jìn)行多指標(biāo)優(yōu)化，最終確定SMLHI水提工藝的最佳操作條件為加熱溫度150 ℃，保溫時(shí)間84 min，藥材規(guī)格11 cm，溶劑用量為10倍。利用基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了SMLHI水提工藝，為傳統(tǒng)的中藥制藥工藝研究過(guò)程中面臨的工藝參數(shù)改動(dòng)受限、更改成本高昂的情況提供合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，提高研究效率，降低研究成本，對(duì)不同試驗(yàn)規(guī)模下中藥制藥工藝的過(guò)程研究具有較大參考價(jià)值，為中藥的工藝二次開(kāi)發(fā)提供了可供參考的新方法。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；裂區(qū)設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面法；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；丹參川芎嗪注射液；水提工藝；多指標(biāo)優(yōu)化算法；關(guān)鍵工藝參數(shù)；D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法；關(guān)鍵質(zhì)量屬性；滿意度函數(shù)

在中藥大品種二次開(kāi)發(fā)中，一般需要采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化制備工藝參數(shù)[1-4]。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可能面臨某些難以改變的工藝參數(shù)、滿足不了設(shè)計(jì)的完全隨機(jī)化要求的困難。為了提高實(shí)驗(yàn)效率，需要引入裂區(qū)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（split-plot experiment design）方法[5-6]。與其他實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法相比，裂區(qū)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)主區(qū)將一個(gè)或多個(gè)作為副區(qū)的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)、隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)、拉丁方設(shè)計(jì)等結(jié)合起來(lái)，可以適用于實(shí)驗(yàn)中有部分因子較難改變的情況，在醫(yī)藥領(lǐng)域常用于新型藥物制劑的配方設(shè)計(jì)與優(yōu)化[7-12]。在中藥制藥工藝研究中，在質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念的指導(dǎo)下合理應(yīng)用裂區(qū)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有助于避免在研究過(guò)程中因?yàn)楦淖僅TCF而導(dǎo)致后續(xù)研究中斷或?qū)罄m(xù)研究造成干擾，同時(shí)幫助提高實(shí)驗(yàn)效率，減少不必要的資源浪費(fèi)。

響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是一種隨機(jī)優(yōu)化過(guò)程的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法[13]，目前在中藥生產(chǎn)過(guò)程工藝優(yōu)化的研究中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[14-15]，主要用于考察工藝參數(shù)間相互作用以及工藝參數(shù)的二次效應(yīng)對(duì)工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）在過(guò)程建模、優(yōu)化方面具有強(qiáng)大的信息提取能力，較RSM可以建立更加復(fù)雜關(guān)系的模型，尤其是非線性關(guān)系，是一種多項(xiàng)式回歸建模的替代方法[13]。近年來(lái)，ANN在過(guò)程預(yù)測(cè)及工藝優(yōu)化方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并常常表現(xiàn)出比RSM更好的預(yù)測(cè)能力[16-17]。

丹參川芎嗪注射液（and Ligustrazine Hydrochloride Injection，SMLHI）是由丹參提取液和鹽酸川芎嗪組成的復(fù)方制劑，臨床主要用于治療閉塞性腦血管疾病及其他缺血性心血管疾病[18-20]。本研究以SMLHI生產(chǎn)的首要環(huán)節(jié)丹參水提工藝為研究對(duì)象，通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)分析與篩選設(shè)計(jì)確定丹參水提的關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameter，CPP）。在此基礎(chǔ)上，考慮到加熱效率的調(diào)整難以隨機(jī)進(jìn)行，采用基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。同時(shí)，采用RSM和ANN兩種建模方法處理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)，建立丹參水提工藝CPP和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute，CQA）之間的定量關(guān)系。最后，選擇較優(yōu)的模型用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，并通過(guò)多指標(biāo)優(yōu)化算法考察丹參提取液的綜合質(zhì)量，確定最佳操作條件。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Cary60型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)及Agilent1100型高效液相色譜儀，配四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、ChemStation工作站，安捷倫科技有限公司；XS105、AB204-N型電子分析天平、SevenMult型pH綜合測(cè)試儀，梅特勒-托利多上海有限公司；SE6001F電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；DHG- 9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZCY-15B型數(shù)控超級(jí)恒溫槽，寧波天恒儀器廠。

1.2 試劑

丹參藥材由貴州拜特制藥有限公司提供，經(jīng)貴州拜特制藥有限公司茍維工程師鑒定為正品丹參（植物基原為唇形科鼠尾草屬植物丹參Bunge的干燥根和根莖），藥材中丹酚酸B含量由課題組根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版方法[21]測(cè)定而得；對(duì)照品丹參素鈉（批號(hào)171027，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、原兒茶醛（批號(hào)171126，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、紫草酸（批號(hào)170825，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、迷迭香酸（批號(hào)171009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、丹酚酸B（批號(hào)171102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、丹酚酸A（批號(hào)170920，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；苯酚（批號(hào)20141121）購(gòu)自美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司；硫酸（批號(hào)20171201）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；超純水由超純水系統(tǒng)（Milli-Q?Synthesis，美國(guó)Millipore公司）制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參水提工藝操作流程

以篩選實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件為例，取事先揀選好的5 cm長(zhǎng)的特定丹參藥材145 g，加1160 mL水（pH 7，pH值用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)）浸泡12 h，期間開(kāi)啟數(shù)控恒溫槽，將油預(yù)熱至140 ℃。浸泡完成后，油浴加熱升溫至沸騰，保溫60 min，傾出一提液。隨后加入1160 mL水溶液（pH 7）進(jìn)行二次提取，同樣升溫至沸騰后繼續(xù)保溫60 min，傾出二提液，與一提液均勻混合，作為后續(xù)測(cè)試所需樣本溶液。

2.2 工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇及分析方法

丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A是目前丹參相關(guān)中藥制劑中主要的可追溯質(zhì)量標(biāo)志物[22-23]，本研究選擇這6個(gè)成分的提出率作為提取工藝效率的指征，作為工藝研究的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute，CQA）。此外，提取液中雜質(zhì)成分的存在不利于提取液的后續(xù)純化及精制。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖類(lèi)成分是SMLHI原料丹參提取物中的主要雜質(zhì)成分，占提取物總固含量的60%以上，其存在會(huì)顯著影響產(chǎn)品黏度、滲透壓等[14]。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、總糖及總固體的提出率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

單個(gè)指標(biāo)提出率計(jì)算方法如公式（1）。

提出率＝提取液中含量（濃度）×提取液質(zhì)量（體積）/藥材質(zhì)量 （1）

在本研究中，采用高效液相色譜與紫外檢測(cè)器聯(lián)用（HPLC-UV）法[18]測(cè)量樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A 6種成分的含量；根據(jù)《中國(guó)藥典》[21]規(guī)定的苯酚-硫酸法測(cè)定提取液的總糖含量，藥典規(guī)定的恒重法測(cè)定提取液的總固含量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.3.1 篩選實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 為滿足對(duì)中藥注射液的安全性與有效性的雙重保證，采用加權(quán)多元線性回歸系數(shù)法篩選對(duì)結(jié)果影響較大的參數(shù)[24]。該方法已在多項(xiàng)中藥制藥過(guò)程工藝研究中進(jìn)行了實(shí)踐，且被證明具有較好的應(yīng)用價(jià)值[15-16,25-26]。在本實(shí)驗(yàn)中，考慮到酚酸類(lèi)成分為丹參提取物中的主要活性成分，因此在篩選CPP時(shí)重點(diǎn)考慮各工藝參數(shù)對(duì)酚酸類(lèi)成分的影響，以各酚酸類(lèi)成分在標(biāo)準(zhǔn)提取液（本研究中，以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣的中心點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)提取液）中的含量作為權(quán)重，其與回歸模型相關(guān)系數(shù)的乘積作為該指標(biāo)調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)（adjusted correlation coefficient，ACC）。以同一工藝參數(shù)在各指標(biāo)模型中ACC的絕對(duì)值之和綜合評(píng)價(jià)該工藝參數(shù)對(duì)生產(chǎn)工藝影響的大小，進(jìn)而篩選出對(duì)水提工藝影響較大的工藝參數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.3.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 本研究為了更好地建立CPP與CQA之間的關(guān)系，同時(shí)采用RSM和ANN兩種建模方法，并選擇較優(yōu)的模型用于指導(dǎo)SMLHI的生產(chǎn)。

（1）基于RSM建立CPP和CQA之間定量模型：基于裂區(qū)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)RSM模型以公式（2）表示，由常數(shù)項(xiàng)、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交叉項(xiàng)、區(qū)組效應(yīng)、副區(qū)誤差和主區(qū)誤差組成。

0是常數(shù)，a、a與a為回歸系數(shù)，是水提工藝關(guān)鍵質(zhì)量屬性，X是CPP，β是區(qū)組效應(yīng)，ε是副區(qū)誤差，是主區(qū)誤差，模型方程中移入或移除特定項(xiàng)的值設(shè)定為0.10

（2）基于徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)建立CPP和CQA之間定量模型：徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)（radial basis function network，RBF）作為ANN的一種，是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、收斂速度快、能夠逼近任意非線性函數(shù)的網(wǎng)絡(luò)，較多層感知器相比較，達(dá)到相同模型精度需要的參數(shù)更少，對(duì)小樣本數(shù)據(jù)有較好的擬合效果[27-28]。本研究以各組的工藝條件作為輸入向量，輸入節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)等于CPP的個(gè)數(shù)；隱含層中心點(diǎn)采用隨機(jī)選取的方式進(jìn)行，基函數(shù)選用高斯函數(shù)，如公式（3）所示；輸出層為線性單元，與隱含層全連接，因此實(shí)際輸出可以用公式（4）表示。徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

Φ＝(||－u||)＝exp(?||－u||/22) （3）

為輸入向量（工藝參數(shù)），u為基函數(shù)的中心，為基函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差，w為權(quán)重系數(shù)

圖1 RBF結(jié)構(gòu)

為了綜合比較2種模型的性能，選擇2和預(yù)測(cè)平均相對(duì)偏差（mean relative error，MRE）對(duì)2種建模方法進(jìn)行比較分析。

real為關(guān)鍵質(zhì)量屬性測(cè)量值，pre為關(guān)鍵質(zhì)量屬性預(yù)測(cè)值

2.3.3 基于滿意度函數(shù)確定最佳操作條件 在實(shí)際生產(chǎn)中，有效成分與雜質(zhì)的控制往往較為矛盾，2類(lèi)物質(zhì)的提出規(guī)律總是呈現(xiàn)出較為一致的趨 勢(shì)[11,29]。為了在提取過(guò)程中盡可能多的提取出酚酸類(lèi)成分，并盡可能減少雜質(zhì)提出，從而降低產(chǎn)品后處理中分離與純化的難度，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究綜合考量各CQA，進(jìn)一步利用多指標(biāo)算法確定最佳的操作條件。

滿意度函數(shù)法是一種常用的綜合多個(gè)優(yōu)化目標(biāo)的方法，它將各響應(yīng)指標(biāo)的預(yù)測(cè)值分別通過(guò)各自的滿意度函數(shù)轉(zhuǎn)化成該指標(biāo)的滿意度，再將多個(gè)滿意度合并成一個(gè)總體滿意度，以便對(duì)得到的總體滿意度函數(shù)進(jìn)行單目標(biāo)優(yōu)化[3,30]?？傮w滿意度（）的計(jì)算如公式（6）所示。

所有計(jì)算由Microsoft Office Excel 2016（美國(guó)Microsoft公司）、Design-expert 8.0.7（美國(guó)Stat-Ease公司）和Matlab R2019b（美國(guó)MathWorks公司）軟件完成。

2.4 CPP篩選

2.4.1 基于Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)的CPP篩選實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)調(diào)研[11,29]，挑選出6個(gè)待篩選的CPP：加熱溫度（1）、浸泡時(shí)間（2）、保溫時(shí)間（3）、飲片質(zhì)量（4，以藥材中丹酚酸B含量表示）、藥材規(guī)格（5，藥材切碎程度）和溶劑pH值（6）。并進(jìn)一步采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察上述6個(gè)待篩選的CPP，根據(jù)SMLHI生產(chǎn)過(guò)程的實(shí)際工藝確定各參數(shù)的操作范圍。各個(gè)參數(shù)的設(shè)定水平及篩選實(shí)驗(yàn)的具體工藝條件參數(shù)見(jiàn)表1。此外，溶劑倍量會(huì)顯著影響提取效率，在相關(guān)研究中均被視作CPP。

表1 SMLHI水提工藝PB篩選實(shí)驗(yàn)的參數(shù)水平和實(shí)驗(yàn)條件

*括號(hào)中數(shù)字為各參數(shù)的相應(yīng)水平

*numbers in parentheses were setting levels of parameters, respectively

2.4.2 CPP篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果 篩選實(shí)驗(yàn)樣品溶液中各組分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，各工藝指標(biāo)相應(yīng)的回歸系數(shù)及權(quán)重系數(shù)見(jiàn)表3。由表3可知，6個(gè)酚酸模型的決定系數(shù)（2）均大于0.605，總固體與總糖模型的2大于0.663，各個(gè)指標(biāo)的回歸模型均能描述工藝參數(shù)對(duì)指標(biāo)的大部分影響。

水提工藝各影響酚酸提取效率的潛在CPP（1～6）的原始及調(diào)整后回歸系數(shù)絕對(duì)值之和分別為0.262、0.065、0.170、2.404、0.000、0.000與0.071、0.018、0.047、7.539、0.000、0.000。說(shuō)明藥材中丹酚酸B含量、加熱溫度和保溫時(shí)間3個(gè)參數(shù)調(diào)整后的回歸系數(shù)絕對(duì)值之和大于其他工藝參數(shù)，即這3個(gè)參數(shù)對(duì)水提工藝中各酚酸的提出率變化有較顯著的影響。此外，據(jù)表3可知，藥材規(guī)格可以顯著影響總固體和總糖的提出率。由于藥材中丹酚酸B的含量在實(shí)際生產(chǎn)中采購(gòu)過(guò)程會(huì)予以控制，因此本研究不進(jìn)一步進(jìn)行考慮。綜上，最終選擇加熱溫度（1）、保溫時(shí)間（3）、藥材規(guī)格（5）和溶劑倍量（7）為需要優(yōu)化指標(biāo)。

2.5 CPP優(yōu)化

2.5.1 基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在丹參提取工藝的實(shí)際操作中，無(wú)論是小試、中試還是商業(yè)規(guī)模下的試驗(yàn)，對(duì)提取罐溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)整都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效率與溫控精度：首先，加熱器的實(shí)時(shí)加熱效率及溫度本身較難調(diào)整；同時(shí)，一旦對(duì)加熱器的加熱效率進(jìn)行調(diào)整，如不經(jīng)過(guò)一段較長(zhǎng)的等待時(shí)間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的升溫曲線也會(huì)隨之發(fā)生變化。此外，這樣的變更也會(huì)極大增加時(shí)間成本與經(jīng)費(fèi)成本。因此，本實(shí)驗(yàn)采用基于裂區(qū)的D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將加熱溫度設(shè)為困難因子（hard-to-change factor，HTCF），保溫時(shí)間、藥材規(guī)格和溶劑用量（以倍量表示）設(shè)為易于改變因子（easy-to-change factor，ETCF），各工藝參數(shù)的水平設(shè)定與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

表2 SMLHI水提工藝的PB篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 SMLHI水提工藝的PB實(shí)驗(yàn)各評(píng)價(jià)指標(biāo)多元線性回歸模型的R2、回歸系數(shù)及指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)

“/”代表該工藝對(duì)模型影響不顯著

“/” the slash represents the corresponding item with no significance

2.5.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的CQA選擇 本研究基于SMLHI實(shí)際生產(chǎn)情況和《中國(guó)藥典》要求，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中對(duì)CQA進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。藥典規(guī)定，SMLHI中的主要藥效成分為鹽酸川芎嗪與丹參素。丹參藥材中成分主要為丹酚酸B、丹參素等酚酸主要是由丹酚酸B經(jīng)過(guò)一系列降解反應(yīng)后產(chǎn)生[31-32]。因此，基于對(duì)丹酚酸B降解路徑的分析，本實(shí)驗(yàn)將紫草酸、丹酚酸A及丹參素折算成相應(yīng)丹酚酸B物質(zhì)的量，以四者物質(zhì)的量的總和視作酚酸提出量，以該指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)酚酸類(lèi)成分的提取規(guī)律。此外，考慮到雜質(zhì)成分含量差異會(huì)影響提取液的物性參數(shù)以及后續(xù)純化工藝，因此，選取總酚酸純度（總酚酸純度＝酚酸提出量/總固體提出量）評(píng)價(jià)提取液質(zhì)量?；谝陨暇C合考慮，選擇酚酸提出率、總酚酸純度、迷迭香酸提出率、總糖提出率和總固體提出率作為優(yōu)化工藝的CQA。

2.5.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

（1）RSM模型：根據(jù)表4，采用Design-Expert軟件建立多指標(biāo)優(yōu)化模型，經(jīng)顯著性分析，得到模型的回歸系數(shù)、2及值見(jiàn)表5。從表5可知，各CQA模型2均大于0.75，調(diào)整2均大于0.68，表明模型能解釋絕大部分變異。其中，加熱溫度對(duì)各個(gè)指標(biāo)影響都不顯著，對(duì)比篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加熱溫度的不同主要影響的是酚酸類(lèi)成分組成?？赡茉蚴羌訜釡囟炔煌瑢?duì)丹酚酸B降解存在一定程度的影響。提取時(shí)間和溶劑倍量對(duì)各成分提出率的相關(guān)系數(shù)都為正值，說(shuō)明隨著提取時(shí)間和溶劑用量增加各成分提出率都能增大，但延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)降低總酚酸純度。藥材規(guī)格對(duì)各成分提出率的相關(guān)系數(shù)均為負(fù)值，說(shuō)明藥材粉碎程度越大，各成分越容易提取出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與提取傳質(zhì)規(guī)律相吻合，溶劑倍量的增大，可以提高藥材內(nèi)外濃度差，增加傳質(zhì)推動(dòng)力；藥材規(guī)格越大，即藥材比表面積越小，傳質(zhì)阻力就越大[33]。

表4 水提工藝裂區(qū)D-優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)水平設(shè)定及結(jié)果

*參數(shù)的相應(yīng)水平

*numbers in parentheses were setting levels of parameters, respectively

表5 水提工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)RSM模型的回歸系數(shù)、R2和調(diào)整后R2

&相應(yīng)項(xiàng)的值

&numbers in parentheses werelevels of parameters, respectively

（2）RBF模型：BRF模型隱含層節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)太少模型會(huì)欠擬合，而節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)過(guò)多會(huì)造成過(guò)擬合，因此對(duì)隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。隨機(jī)選取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中28組作為校正集，7組作為驗(yàn)證集，各指標(biāo)模型的2和交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）隨節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)的變化趨勢(shì)如圖2所示。

依據(jù)圖2結(jié)果，最終選擇酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總糖提出率、總固提出率和總酚酸純度RBF模型的隱含層節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)依次為12、11、6、10、14，并用7組驗(yàn)證集實(shí)驗(yàn)對(duì)訓(xùn)練好的RBF模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，結(jié)果如表6所示。

從表6中可以發(fā)現(xiàn)，單克藥材中的酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總糖提出率、總固體提出率RBF模型外部驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）依次為0.260 6%、0.013 1%、4.859 4%、2.861 5%，總酚酸純度外部驗(yàn)證均方根誤差為0.419 3%，結(jié)果均較好，表明RBF可以較好的應(yīng)用于丹參水提過(guò)程的設(shè)計(jì)建模分析，且具有良好的預(yù)測(cè)性能。

表6 RBF模型性能評(píng)估結(jié)果

2.5.4 RSM和RBF模型比較 本研究以2和MRE為模型質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)2種模型進(jìn)行比較分析。28組校正集的RSM和RBF模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值關(guān)系見(jiàn)圖3，各指標(biāo)模型的2和預(yù)測(cè)MRE見(jiàn)表7。容易發(fā)現(xiàn)，除了總糖提出率模型2較RSM模型較差以外，RBF模型性能均較優(yōu)于RSM模型。因此，本研究在所建RBF模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)多指標(biāo)優(yōu)化。

表7 水提工藝的RSM和RBF模型的R2和MRE

“*”處相應(yīng)指標(biāo)代表模型具有較好的預(yù)測(cè)性能

Indexes with “*” in the table represented better model performances

2.6 基于滿意度函數(shù)的最佳操作條件確定

根據(jù)生產(chǎn)情況和經(jīng)驗(yàn)，設(shè)定酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總酚酸純度需要滿足的最小值以及總糖提出率、總固提出率需要滿足的最大值，并計(jì)算在操作范圍內(nèi)各指標(biāo)能達(dá)到的最大值或最小值。在本研究中，為了保證產(chǎn)品藥效活性，賦予有效成分較大權(quán)重。各指標(biāo)設(shè)定的最值、權(quán)重、滿意度計(jì)算公式見(jiàn)表8，在此基礎(chǔ)上，計(jì)算RBF模型的SMLHI水提工藝最佳操作條件。具有最佳滿意度的操作參數(shù)為加熱溫度150 ℃，保溫時(shí)間84 min，藥材規(guī)格11 cm，溶劑倍量為10；滿意度為0.595 9。

表8 水提工藝CQA范圍及權(quán)重

max、min分別為計(jì)算所得操作范圍內(nèi)指標(biāo)能達(dá)到的最大值、最小值

max,minmeans the maximum and minimum value that an index could achieve

3 討論

本研究在QbD理念的指導(dǎo)下，系統(tǒng)地考察了SMLHI生產(chǎn)過(guò)程的丹參水提工藝。首先，通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及加權(quán)回歸系數(shù)法篩選出了影響丹參水提的CPP。接著，為了提高實(shí)驗(yàn)效率與操作精度，采用基于裂區(qū)D-最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并通過(guò)RSM、RBF 2種建模方法建立了CPP和CQA間的定量關(guān)系，2種模型的考察結(jié)果均較好。與RSM模型相比，訓(xùn)練所得的BRF模型整體性能較優(yōu)，表明即使在數(shù)據(jù)量較小、實(shí)驗(yàn)運(yùn)行次數(shù)有限的情況下，ANN也能表現(xiàn)出較好的擬合和預(yù)測(cè)能力。但是，RSM模型較ANN模型能夠更加直觀的表達(dá)工藝參數(shù)對(duì)指標(biāo)的影響。最后，本研究使用多指標(biāo)優(yōu)化算法綜合考察了丹參提取液質(zhì)量，并基于較優(yōu)的ANN模型確定了SMLHI水提工藝最佳的生產(chǎn)條件。

傳統(tǒng)的中藥制藥過(guò)程工藝優(yōu)化研究過(guò)程中，當(dāng)工藝參數(shù)的改動(dòng)受限或更改成本高昂時(shí)，為充分發(fā)掘因子間的交互作用，需要引入特定的研究方法。本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中利用了基于裂區(qū)設(shè)計(jì)的優(yōu)化方法，有效避免研究工作中工藝參數(shù)的改動(dòng)受限，通過(guò)該設(shè)計(jì)方法得到合理的實(shí)驗(yàn)方案，有助于在降低研究成本的同時(shí)仍能對(duì)過(guò)程實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)優(yōu)化。此外，本研究將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與ANN、多指標(biāo)優(yōu)化算法相結(jié)合，更好的建立了SMLHI提取工藝CPP和CQA之間的關(guān)系，并確定了丹參水提液質(zhì)量最優(yōu)的生產(chǎn)條件。本研究能夠幫助提高研究效率并降低研究成本，對(duì)不同試驗(yàn)規(guī)模下中藥制藥工藝的過(guò)程研究具有較大參考價(jià)值，為中藥制藥工藝的研究與二次開(kāi)發(fā)提供了新的參考方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of water extraction process ofand Ligustrazine Hydrochloride Injection via split-plot based D-optimal experimental design

ZHAO Fang1, CHEN Ze-qi1, LI Wen-zhu1, GOU Wei2, LIU Fei2, ZHANG Cheng-yi2, QU Hai-bin1

1. Pharmaceutical Informatics Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 2. Guizhou Baite Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550008, China

Quality by design (QbD) concept was applied to guide the efficient optimization of the water extraction process forand Ligustrazine Hydrochloride Injection (SMLHI).Firstly, Plackett-Burman experimental design method was used to screen critical process parameters (CPPs). Secondly, in order to improve the study efficiency, split-plot based D-optimal methodology was applied to implement experimental design. To obtain more process information, response surface method (RSM) and artificial neural network (ANN) were used to establish the regression model between CPPs and critical quality attributes (CQAs) for the extraction. Finally, after comparison of the two models, the optimum operating conditions were determined with the multi-index optimization algorithm by a better regression model.The study efficiency was improved by the split-plot method to conduct the experimental arrangement. Then, the ANN method showed better modeling performance than the RSM in this study, and then it was taken as the final optimum model for the multi-index optimization. The optimal operating conditions of the extraction process for SMLHI were follows: The heating temperature was 150 ℃, extraction time was 84 min, specification of medicinal material was 11 cm, and the ratio of material to water was 10.This study optimized the water extraction process for SMLHI by introducing the split-plot design into the process optimization of traditional Chinese medicine. Split-plot design methodology can provide reasonable experimental design solutions to improve research efficiency and reduce research costs for pharmaceutical process research in traditional Chinese medicine, which faces limited changes in process parameters and high costs. And it has a greater reference value for the process study of Chinese medicine pharmaceutical process under different test scale, and provides a new method for the secondary development of Chinese medicine pharmaceutical process for reference.

quality by design; split-plot design; response surface methodology; artificial neural network;and Ligustrazine Hydrochloride Injection; water extraction process; multi-index optimization; critical process parameter; D-optimal design; critical material attribute; satisfactory function

R284.1

A

0253 - 2670(2021)01 - 0045 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.007

2020-09-07

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2018ZX09201011-002）

趙 芳，女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹扑幑に囇芯?。E-mail: z_fang@zju.edu.cn

瞿海斌，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥制藥過(guò)程質(zhì)量控制研究。Tel: (0571)88208428 E-mail: quhb@zju.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]