毛祥娣，楊澤希，叢 馨△

（1北京大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，2北京大學醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，北京 100191）

緊密連接（tight junction，TJ）是由多個蛋白構成的大分子復合物，廣泛分布在所有上皮細胞和內皮細胞的頂側膜區(qū)域。TJ通過調節(jié)水、離子和大、小分子物質經旁細胞途徑的轉運以及限制細胞膜脂質和蛋白的自由流動，發(fā)揮著重要的屏障和柵欄功能。狹義的TJ 復合物主要包括跨膜蛋白，如密封蛋白（claudin）家族、閉合蛋白（occludin）和連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）等，以及胞漿蛋白，如閉鎖小帶蛋白（zonula occludens，ZO）和扣帶素（cingulin）等［1］；廣義的TJ 復合物還包括與調控TJ相關的信號調控蛋白，如G 蛋白、非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase）等，以及轉錄因子，如激活蛋白1（acti?vator protein-1，AP-1）和ZO-1 相關核酸結合蛋白（ZO-1-associated nucleic acid-binding protein，ZONAB）等。

tricellulin 是第一個被發(fā)現(xiàn)的主要表達在三個相鄰細胞接頭處的TJ 跨膜蛋白。上述提到的TJ 跨膜蛋白主要分布在兩個細胞間側膜，被稱為兩細胞緊密連接（bicellular tight junction，bTJ），而tricellulin 與它們不同，因其分布特點而被稱為三細胞緊密連接（tricellular tight junction，tTJ）。已有研究顯示，tri?cellulin在封閉大分子物質經旁細胞途徑的轉運中發(fā)揮了決定性作用，并且對維持tTJ 和bTJ 結構的完整性至關重要。本文將從tricellulin 的結構、表達和分布、功能與疾病以及相關的調控機制幾個方面進行綜述。

1 tricellulin的結構

早在1969 年，Staehelin 等利用冰凍蝕刻技術觀察到2 個相鄰細胞間的TJ“拉鏈”在到達與第3 個細胞接觸時變?yōu)榇怪毕蚧追较蜓由?，因此在三細胞接頭處并不匯聚，而是斷開的。1973年，Staehelin在電鏡下發(fā)現(xiàn)在三細胞接頭處存在3 對與頂膜垂直的獨立TJ 鏈，從而圍成一個“中心管”（圖1）。隨后的30多年，研究者檢測并深入研究了30多種bTJ分子，但受檢測技術的限制一直未見tTJ 分子被報道。直到2005 年，Ikenouchi 等［2］首次發(fā)現(xiàn)并命名了tTJ 蛋白tricellulin。后來，研究者又證實，可調控tricellulin分布的angulin家族亦屬于tTJ蛋白。

Figure 1.The structure diagram of tricellular and bicellular tight junctions.At tricellular contacts，there are 3 pairs of independent tight junction chains perpendicu?lar to the apical membrane，thus forming a "central tube".bTJ：bicellular tight junction；tTJ：tricellular tight junction.圖1 三細胞緊密連接和兩細胞緊密連接的結構示意圖

tricellulin 是由位于染色體5q13.2 上的Marveld2基因編碼，與常染色體隱性非綜合性遺傳性耳聾49位基因（autosomal recessive non-syndromic deafness gene 49，DFNB49）位點相連［3］。在蛋白結構上，人tricellulin 是一個由558 個氨基酸殘基構成的四次跨膜蛋白，分子量約為64 kD，其N 末端和C 末端均位于胞漿內。由于共同具有一個保守的中央MARVEL域（MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link），tricellullin（又稱MARVELD2）、oc?cludin（又稱MARVELD1）及MARVELD3 共同屬于緊密連接相關的MARVEL 家族蛋白（tight junctionassociated MARVEL protein，TAMP）［4-5］。其中，tri?cellulin 和occludin的結構最為相似，均包含一個C末端的卷曲螺旋（coiled-coil，CC）結構域，該結構域與RNA 聚合酶II 轉錄因子ELL 家族的C 末端有很高的同源性［6］。已有研究表明，tricellulin 的C 末端在決定其在細胞膜上的定位中發(fā)揮重要作用，如其CC 結構域內氨基酸發(fā)生突變，可破壞它與ZO-1 的相互作用造成tricellulin 的定位異常，從而引起前庭和耳蝸旁細胞屏障功能障礙，最終導致聽力損傷［7-8］。

2 tricellulin的表達和分布

正常的表達量和正確的分布是tricellulin 發(fā)揮屏障功能的前提。盡管tricellulin 是一個近年來新發(fā)現(xiàn)的tTJ 分子，但其在多種組織和器官中的表達和分布特點已相繼被報道。

2.1 tricellulin 的表達 tricellulin 存在于哺乳動物多種上皮組織中，如小腸、胃、腎、肺、肝、睪丸、皮膚、前庭和耳蝸等，以及上皮細胞系，如腸上皮HT-29/B6、Caco-2 和T84 細胞、腎上皮MDCK I、MDCK II 和M-1 細胞以及乳腺上皮EpH4 細胞等［9-12］。Tricellulin還在腦和視網膜的微血管內皮以及腦微血管內皮細胞系（brain microvascular endothelial cells，BMECs）中存在表達［13］。據此推測，tricellulin 可廣泛地表達于全身器官和組織的上皮及內皮細胞。

值得注意的是，在人單核細胞系THP-1 以及成熟的樹突狀細胞中也檢測到tricellulin 的mRNA 表達，提示tricellulin 可能參與了樹突狀細胞與上皮細胞之間緊密連接樣結構的形成，從而幫助維持上皮屏障的完整性［14］。此外，作為腦中常駐的重要免疫細胞的小神經膠質細胞中也發(fā)現(xiàn)tricellulin mRNA 和蛋白的表達［15］，再次提示除了構成上皮和內皮屏障外，tricellulin 在免疫細胞中的表達及意義也值得深入研究。

2.2 tricellulin 的分布 一直以來，tricellulin 如何特異性地表達在三細胞接頭處是很多學者關注的一個重要問題。目前研究認為，tricellulin 不能自行定位在三細胞間，需要通過與同為tTJ的angulin家族分子相互作用從而被招募到三細胞接頭處［16-17］。angu?lin家族（angulin-1～3）是I型跨膜蛋白，具有位于細胞外的N 末端免疫球蛋白樣結構域（immunoglobulinlike domain）和位于胞漿內的C末端。

angulin-1 又稱脂解激活脂蛋白受體（lipolysis stimulated lipoprotein receptor，LSR）。在特異性敲低angulin-1的小鼠乳腺上皮EpH4細胞中，tricellulin不能很好地定位在tTJ 處，而是均勻分布在兩細胞間，呈現(xiàn)與bTJs相似的分布模式，表明angulin-1對tricel?lulin 的分布具有重要的招募作用［18］。進一步研究證實，angulin-1蛋白易發(fā)生磷酸化修飾，在人類和小鼠中已檢測到至少30 個磷酸化位點［19］。angulin-1 的C末端發(fā)生磷酸化后可與tricellulin 相互作用，從而招募tricellulin 到三細胞間［18-21］。angulin-2 又稱含免疫球蛋白樣結構域受體1（immunoglobulin-like domain containing receptor 1，ILDR1）。在Ildr1基因敲除小鼠的內耳上皮中，tricellulin 仍可定位在tTJ 處，且能較好地維持bTJ鏈與中心管的密封元件的連接，這可能與此時angulin-1 的補償作用有關［22］。此外，angu?lin-2 的細胞外域可能在tTJ 處形成同源三聚體結構，然而其具體機制尚不清楚［23］。angulin-3 又稱IL?DR2，與angulin-1 和-2 相比其招募tricellulin 的作用最弱［18］，目前研究甚少。

除了angulins 分子的作用外，敲減occludin 也會導致tricellulin 重分布至兩細胞間，部分補償了此時occludin 的缺失［24］。在僅過表達tricellulin 的犬腎上皮MDCK II 細胞中，tricellulin 可同時分布在bTJ 和tTJ 處；而如果共同過表達tricellulin 和occludin，tri?cellulin 則僅分布在tTJ 處。這表明bTJs 分子的存在對tricellulin 在三細胞接頭處的定位也是一個重要的影響因素。

3 tricellulin的功能及在疾病中的作用

3.1 tricellulin的功能 與bTJ所構成的兩細胞側膜間隙相比，tTJ 所組成的“中心管”具有更大的孔徑（直徑約10 nm），因此有學者提出tTJs 可能與一些大分子物質經旁細胞途徑的轉運有關，而bTJs 則與離子和小分子物質的轉運有關。在MDCK 細胞中，過表達tricellulin 可降低大分子物質（分子量＞4 kD）的通透性，但不影響離子轉運［25］，這與上述推測相符。但是，tricellulin 究竟是否影響離子轉運仍存在爭議。例如，在內耳中，tricellulin 主要表達在耳蝸和前庭上皮中，參與構成不同區(qū)室間的屏障；當tricellulin 基因發(fā)生突變時，屏障受到破壞，導致不同區(qū)室的淋巴液中離子的通透性增大，最終造成不同程度的聽力損傷［26］。在EpH4 細胞中，敲低tricellulin 可同時影響tTJs和bTJs的形成，引起離子的通透性增加，提示tri?cellulin可通過影響bTJs結構的完整性進而間接調控離子轉運［2］。此外，在MDCK 細胞中，tricellulin 還可作為氧化還原反應感受器在缺氧和還原劑的作用下發(fā)生由三細胞間向兩細胞間的重分布，代償了此時occludin的缺失，提示tricellulin在bTJs表達缺失時可發(fā)揮重要的屏障補償作用［27］。這些研究表明，tricel?lulin 在調控旁細胞途徑的通透性、尤其是在大分子物質的轉運中發(fā)揮關鍵作用，tricellulin 的異?？蓞⑴c一些上皮或內皮屏障功能障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展；此外，tricellulin 對bTJ 結構和功能的影響及相互作用也值得關注。

3.2 tricellulin在疾病中的作用

3.2.1 非綜合性遺傳性耳聾 目前，Marveld2被認為是人類和小鼠常染色體隱性非綜合性遺傳性耳聾DFNB49 的致病基因［28］。tricellulin 基因敲除小鼠也表現(xiàn)出與耳蝸毛細胞退化有關的早發(fā)性漸進性聽力損傷［29］。

tricellulin 的C 末端是受angulin 招募所必需的，一旦缺失或突變將導致tricellulin 無法定位在tTJ處，這被認為是非綜合性遺傳性耳聾的一個致病原因［18，30］。但除了耳聾這一癥狀外，患者沒有出現(xiàn)其他明顯的表型，這可能是因為內耳上皮缺失tricellu?lin 易產生較為嚴重的屏障功能障礙，而在其他器官中其他TJ 蛋白可能起到補償作用有關。研究證實，tricellulin 第497 位精氨酸位點基因突變（R497*）能夠過早終止蛋白質的形成，從而導致C 末端ELL 結構域的喪失和tricellulin 的錯誤定位，因此tricellulinR497*敲入小鼠呈現(xiàn)出與基因敲除小鼠相似的表型，由此證實C 末端位點突變所導致的tricellulin 錯誤定位可消除tricellulin 的屏障功能［30］。此外，occludin基因敲除小鼠也出現(xiàn)聽力喪失，且在耳蝸毛細胞中發(fā)現(xiàn)tricellulin 的定位異常，這與前面提及的當occludin缺失時tricellulin 可發(fā)生從tTJ 向bTJ 處重分布的代償作用有關，因而引起上皮屏障功能的喪失和毛細胞的凋亡，也再次表明tricellulin 在維持正常聽力中起著重要的作用［18］。

3.2.2 炎癥性腸病 在兩種經典的炎癥性腸病即潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者的腸上皮標本中檢測發(fā)現(xiàn)，tricellulin 的蛋白表達水平僅在潰瘍性結腸炎中顯著下調，而在克羅恩病中不變［31］。在人結腸上皮HT/B6 細胞中，通過一種可視化實時觀察方法顯示只經旁細胞途徑轉運的大分子物質（分子量為10 kD 的右旋糖苷）主要是經由tricellulin 介導的tTJ 途徑而通透的。動物模型進一步證明，在潰瘍性結腸炎發(fā)生的早期，tricellulin 表達的下調可能通過破壞tTJ 的緊密性，從而允許抗原等大分子物質通過，最終啟動局部的免疫炎癥反應并加重疾病的進程。由此作者推測，在炎癥性腸病的早期階段，針對上皮屏障功能的缺失以及大分子藥物在體內不受控制的吸收等改變，tricellulin 可能是一個潛在的有效治療靶點。

3.2.3 細菌感染性疾病 研究證實，一些致病菌可以通過攻擊tTJ 來有效感染上皮細胞。例如，引起細菌性痢疾的志賀痢疾桿菌可侵入結腸上皮并在結腸細胞中繁殖，而這一過程需要以tricellulin 依賴的方式在tTJ 處形成偽足而實現(xiàn)。另外，有學者發(fā)現(xiàn)A 組鏈球菌可通過與tricellulin 的相互作用攻擊由tTJ 介導的大分子物質轉運途徑，進而破壞上皮屏障，這或許可以解釋A 組鏈球菌能夠更深入地侵入至黏膜下層組織的作用機制［32］。由此可見，tricellulin 可作為細菌入侵的一個重要攻擊靶點，如能較好地維持tri?cellulin的表達、分布和屏障功能，將有望為盡早阻斷細菌感染性疾病的發(fā)生發(fā)展提供新思路。

3.2.4 腫瘤 已有很多研究表明，TJ的表達異?？善茐钠琳瞎δ?，使細胞極性喪失，造成細胞間黏附力的降低和細胞-細胞連接的松弛，破壞上皮細胞的接觸抑制，進而促進細胞的異常增殖，最終導致多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證明tricellulin 表達的減少與腫瘤的進展密切相關。例如，在扁桃體鱗狀細胞癌患者受累組織中，tricellulin 和claudin-7 的蛋白表達減少［33］。與正常肝細胞相比，肝癌患者組織中tricellu?lin 的表達顯著減少［34］。肝膽管癌的預后不良，與tri?cellulin 的表達減少相關［35］。在胰腺導管腺癌中，tri?cellulin 的表達水平與癌細胞的分化程度相關，分化好的腺癌中tricellulin 高表達，但在分化差的腺癌中表達較少［10］。此外，在分化不良的胰腺癌患者組織標本中，tricellulin 發(fā)生由細胞膜向細胞核的重分布，而核內表達的tricellulin 可進一步通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號通路增強胰腺癌細胞的增殖和遷移能力，因此tricellulin 的核定位在一定程度上可反映胰腺癌的惡性程度［36］。進一步在人胰腺腺泡上皮癌HPAC 細胞中，特異性敲低tricellulin 可抑制細胞遷移并降低上皮屏障功能［37］。以上研究表明，tricellulin 的表達水平與多種上皮源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，tricellulin 的低表達可能是腫瘤進程及預后的一個潛在標志分子。

3.2.5 血腦屏障與血視網膜屏障 盡管內皮細胞tTJ 的結構和功能特征不如上皮細胞的明顯，但最近的研究已開始關注到tricellulin 在血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）和血視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）中的重要性。BBB 和BRB 的維持對神經元的穩(wěn)態(tài)、局部營養(yǎng)物質的運輸以及阻止炎性細胞和介質的侵入等生理功能有重要意義。研究顯示，tricellulin 在腦和視網膜微血管內皮細胞的三細胞接頭處存在表達［13］。angulin-1 基因敲除小鼠的腦微血管內皮細胞更容易滲透小分子物質（分子量＜450 Da），而在多發(fā)性硬化和腦卒中等BBB 受損的動物模型中亦發(fā)現(xiàn)腦微血管內皮細胞中angulin-1 的表達顯著下降，由于angulin-1 具有招募tricellulin 定位到tTJ處的作用，因此推測上述腦血管疾病時BBB 障礙的發(fā)生可能與tricellulin 有關，但具體機制尚在研究中［38］。

另外，有研究向小鼠尾靜脈注射一種tTJ 的粘合劑——angubindin-1，發(fā)現(xiàn)它可破壞angulin-1 對tri?cellulin 的招募作用進而抑制tricellulin 的屏障功能，從而利于將反義寡核苷酸穿透BBB 轉運到中樞神經系統(tǒng)使目標RNA 沉默，由此實現(xiàn)對中樞神經系統(tǒng)性疾病的靶向性治療效果［39］。因此，尋找合適的能特異性調控tricellulin 開放和關閉的藥物，將為臨床上一些治療性藥物更好地穿透BBB和BRB等血管內皮屏障到達特定器官和組織提供新策略。

4 tricellulin相關的調控機制

盡管已有研究表明tricellulin 在多種器官和組織中廣泛表達，且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展也有密切關系，但目前關于tricellulin 受哪些信號分子及轉錄因子的調控及具體機制的研究仍十分有限。以下是近幾年報道較多的可能調控tricellulin 的幾個機制（圖2）。

4.1 促炎因子白細胞介素13（interleukin-13，IL-13）作用通路 現(xiàn)已知多種促炎因子，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-13等，可通過改變TJ蛋白的表達、分布和功能進而影響上皮或內皮的屏障功能。

前面提及有學者在潰瘍性結腸炎患者標本中證實tricellulin 的蛋白表達降低，經進一步檢測顯示這與在潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展中起關鍵始動作用的促炎因子IL-13 有關［31］。IL-13 可選擇性激活IL-13受體α2（IL-13 receptor α2，IL-13Rα2），繼而活化MAPK家族中的細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2（extra?cellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）和c-Jun N 末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），通過引起轉錄因子AP-1 入核、與tricellulin 啟動子區(qū)結合下調tricellulin 的mRNA 和蛋白表達，從而增加大分子物質經tTJ 途徑的通透性。這表明，IL-13 可通過IL-13Rα2/MAPK（ERK1/2 和JNK）/AP-1 信號通路下調tricellulin 的表達，從而造成大分子物質如抗原經三細胞間進入腸黏膜上皮產生局部免疫炎癥反應。該作用機制的發(fā)現(xiàn)為早期治療潰瘍性結腸炎提供了潛在干預靶點，也豐富了我們對tricellulin 表達相關的信號調控機制的認識。

4.2 JNK/NF-κB信號通路 JNK是一種應激活化蛋白激酶，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，其在細胞增殖、分化及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［40-41］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，JNK 可參與調節(jié)不同上皮細胞中TJ 的完整性，包括對tricellulin 表達和功能的調控［42-43］。JNK的激活對人角質形成細胞和結腸上皮細胞的貼壁和TJ的開放至關重要［44-45］。在人胰腺HPAC 中，分別給予促炎因子IL-1β、TNF-α 和IL-1α 均可顯著增加tri?cellulin 在tTJ 處的表達水平，增強上皮的屏障功能。進一步機制研究證實，JNK 是通過活化下游NF-κB信號通路來實現(xiàn)對tricellulin 在轉錄水平上表達的調控作用的［46］。以上結果提示，促炎因子可通過激活JNK/NF-κB 信號通路來上調tricellulin 的mRNA 和蛋白表達，而tricellulin 在tTJ處的表達增加以及相應的屏障功能增強可以阻斷局部炎癥反應，在炎癥反應發(fā)生起始階段發(fā)揮著一定的代償性保護作用。

Figure 2.The related mechanism involved in the regulation of tricellulin.Interleukin-13（IL-13）activates extracellular signal-regu?lated kinase 1/2（ERK1/2）and c-Jun N-terminal kinase（JNK）through interleukin-13 receptor α2（IL-13Rα2），and then reduces the expression of tricellulin by activator protein 1（AP-1），eventually leading to increased permeability of macromo?lecular substances.Proinflammatory factors，such as interleukin-1α/β（IL-1α/β）and tumor necrosis factor-α（TNF-α），can up-regulate the mRNA and protein expression of tricellulin by activating the JNK/NF-κB signaling pathway.Snail has a negative regulation of tricellulin expression and induces redistribution of the protein to cytoplasm from tricellular tight junc?tion.TNFR：tumor necrosis factor receptor；IL-1α/βR：interleukin-1α/β receptor；NF-κB：nuclear factor-κB.圖2 tricellulin相關的調控機制

4.3 Snail家族轉錄因子 上皮-間充質轉化（epithe?lial-mesenchymal transition，EMT）的特征性表現(xiàn)是細胞間連接的減少和細胞極性的喪失，這同樣也是TJ發(fā)生障礙的標志性改變。很多研究已證實，EMT 在上皮細胞來源的惡性腫瘤的轉化及進程中發(fā)揮了重要的作用，而Snail 信號通路是誘導EMT 發(fā)生的經典信號途徑之一。Snail 家族是一個轉錄因子家族，包括Snail 和Slug，通過引起EMT 和負性調節(jié)claudin 及occludin 等TJ 和黏附連接分子E-cadherin 的表達，在胚胎發(fā)育、組織重建和腫瘤進展中起關鍵作用［47-49］。值得注意的是，tricellulin 的發(fā)現(xiàn)正是通過在過表達Snail 的Eph4 細胞中采用高密度寡核苷酸芯片所篩選出來的，因而Snail 家族分子對tricellulin 的mRNA表達的調控作用是一個非常明確的機制［2］。此外，在胃癌患者標本中的研究發(fā)現(xiàn)，Snail誘導的EMT 對tricellulin 的表達有負調節(jié)作用［50］。在過表達Snail的人胃癌HSC-45細胞中，tricellulin的蛋白表達水平顯著降低，且發(fā)生由tTJ 處向細胞漿的重分布［50］。因此，除上述提及的AP-1 和NF-κB 外，Snail 家族是另一類可參與調控tricellulin 表達的重要轉錄因子，其在多種上皮中對tricellulin 表達的負性調控作用不容忽視。

5 結語

綜上所述，tricellulin 作為tTJ 的重要組成成分，是影響上皮和內皮TJ 屏障功能、特別是對大分子物質的通透性的關鍵蛋白之一。盡管目前對tricellulin的認識仍處于起步階段，其與細胞內、外其他物質之間的相互作用關系、調節(jié)機制及定位表達等仍未完全明了，但從tricellulin 的角度研究疾病，尤其是在耳聾和炎癥性疾病等方面的研究已成為熱點。因此，深入研究tricellulin 的功能及調節(jié)機制，了解其與疾病之間的關系，將加深對TJ 相關疾病發(fā)生發(fā)展的理解并也可為治療相應的疾病提供潛在干預靶點。