李艷青，趙 方，傅金英△，高 蕊，吳 昕，牛小斌

（1河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科，河南鄭州 450003；2河南中醫(yī)藥大學研究生處，河南鄭州 450046；3河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450003）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病，其臨床表現(xiàn)為持續(xù)性無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變及胰島素抵抗［1］。PCOS 的病因復雜，發(fā)病機理尚不明確，但有研究顯示，PCOS 患者較正常人體內(nèi)的氧化應激（oxidative stress，OS）水平明顯升高［2-3］，提示OS可能是PCOS發(fā)病的潛在誘因，從抗氧化的角度認識該疾病可能會發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。目前臨床治療PCOS 多以對癥治療為主（如達英-35 和氟他胺等），但療效有限且副作用大［4］。而中醫(yī)藥治療PCOS 療效溫和持久且不良反應少，已成為近些年的研究熱點［5］。

黃芪甲苷（astragaloside，AST）是一種從黃芪上提取出來的高純度藥物，具有免疫調(diào)節(jié)、器官保護、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及改善胰島素抵抗活性等多種生物活性［6-7］。由于黃芪甲苷含量少、效果好，藥效強度是黃芪多糖的2 倍以上而享有“超級黃芪多糖”的美稱，但目前尚無黃芪甲苷在治療PCOS 方面的報道。本研究擬通過來曲唑誘導建立PCOS 大鼠模型，觀察黃芪甲苷對PCOS 大鼠血清性激素、氧化應激水平及卵巢組織形態(tài)學的影響，探討其對PCOS 大鼠性激素水平和氧化應激損傷的影響，為黃芪甲苷治療PCOS提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠60 只，6～7 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由河南省實驗動物中心提供，合格證號SCXK（豫）2017-0002。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%。

1.2 主要試劑 黃芪甲苷（成都科程生物科技開發(fā)有限公，批號20180512）；來曲唑片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號16113061）；達英-35（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號333A）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；大鼠性激素睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2），促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；甾類激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenetic acute regulatory pro?tein，StAR）、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 和GAPDH抗體（Abcam，批號分別為ab-13897、ab-60232、ab-173054、ab-181602 和ab-186517）；過氧化物酶標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，批號BST12E27C55）。

1.3 儀器 680 型酶標儀（Bio-Rad）；TKY-BMC 石蠟包埋機（湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RM2235切片機（Leica）；DYCZ-24DN 型電泳儀和DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics）。

2 方法

2.1 動物造模及分組處理 將60 只大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分成正常對照（control）組、模型組（model）組、陽性對照達英-35（Diane-35）組，黃芪甲苷低劑量（low dose of AST，AST-L）組和黃芪甲苷高劑量（high dose of AST，AST-H）組，每組12 只。PCOS 造模方法參考前期研究［8］，具體操作為將1 mg/kg 來曲唑溶于質(zhì)量分數(shù)1%的羧甲基纖維素（car?boxylmethyl cellulose，CMC）溶液中，連續(xù)灌胃21 d，制備PCOS 模型，其中正常對照組給予等量1%CMC灌胃。于造模第16 天開始對大鼠進行1 個周期（5 d）的陰道涂片觀察動情周期，若陰道上皮細胞持續(xù)角化為造模成功［9］。造模成功后開始灌胃給藥，根據(jù)前期預實驗結(jié)果，黃芪甲苷低劑量組和黃芪甲苷高劑量組大鼠分別給予12.5 mg/kg 和50 mg/kg 黃芪甲苷灌胃，而達英-35 組大鼠給予0.339 2 mg/kg 達英-35［9］灌胃，對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)3周。

2.2 陰道涂片觀察大鼠動情周期 實驗期間每天早上9 點用蘸有生理鹽水的無菌棉簽緩慢插入大鼠陰道，輕輕地在大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)2 圈并將其順時針均勻地涂在載玻片上，行陰道涂片后自然干燥，蘇木素染色，于顯微鏡下觀察細胞種類和形態(tài)，同時觀察大鼠陰道口徑的變化及充血狀態(tài)，結(jié)合陰道涂片檢查結(jié)果，判斷大鼠性周期的各個時期。

2.3 計算卵巢指數(shù) 末次給藥后，摘取雙側(cè)卵巢和雙角子宮，用鑷子仔細分離并去除臟器表面脂肪組織，濾紙吸拭表面，用分析電子天平稱量質(zhì)量。卵巢指數(shù)=兩側(cè)卵巢總質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

2.4 HE 染色觀察卵巢組織病理學變化 摘取各組大鼠左側(cè)卵巢組織，放入4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水處理后進行常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，行HE 染色，于顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)并拍照。

2.5 ELISA 檢測血清中性激素含量 取各組大鼠血清，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的A值，根據(jù)標準曲線計算血清中T、E2、LH和FSH的含量。

2.6 比色法檢測血清及卵巢組織中SOD、MDA 和GSH-Px 水平 取血清及卵巢組織稱質(zhì)量，組織碾磨至勻漿，4℃、10 000×g離心15 min，取上清液。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據(jù)試劑盒說明書提供的計算公式分別計算MDA和GSH-Px含量及SOD活性。

2.7 Western blot檢測 稱取適量卵巢組織，加入裂解液充分研磨后置于冰浴中勻漿，然后在4℃、10 500×g條件下離心20 min，收集上清液，BCA 法測定上清液中蛋白含量。取等量蛋白樣品進行SDSPAGE，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，洗膜，加入Ⅰ抗（StAR、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗體均1∶1 000 稀釋），4℃搖床過夜，次日加入HRP標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，最后使用ECL 顯色。利用ImageJ 圖像分析軟件進行分析，結(jié)果用灰度值表示，以目的條帶與GAPDH 的灰度值比值，作為目的蛋白表達的相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

通過SPSS 22.0 軟件進行處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差（meas±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠動情周期的影響

如表1 所示，對照組大鼠動情周期正常有規(guī)律；模型組大鼠動情周期紊亂，動情期消失，動情前期時間延長，說明PCOS 大鼠模型構(gòu)建成功；黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠大部分處于動情期，周期恢復規(guī)律；黃芪甲苷低劑量組大鼠大部分仍處于動情前期階段，動情期大鼠較少。

表1 各組大鼠動情周期比較Table 1.Comparison of the estrous cycles of rats in each group（n=12）

2 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠卵巢指數(shù)的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢指數(shù)顯著減少（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

3 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織病理結(jié)構(gòu)的影響

如圖1 所示，對照組大鼠卵巢表面色澤偏紅，表面可見黃體，未見囊狀擴張卵泡；模型組和黃芪甲苷低劑量組大鼠卵巢體積變大，表面蒼白，少見黃體，可見多個囊狀擴張卵泡；黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢體積變小，表面色澤較紅潤可見黃體，囊狀卵泡擴增不明顯。

4 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清性激素水平的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中T 和LH 含量顯著增加（P＜0.05），E2和FSH 含量顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清中T 和LH 含量顯著減少（P＜0.05），E2和FSH 含量顯著增加（P＜0.05）；而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

表2 各組大鼠卵巢指數(shù)比較Table 2.Comparison of the ovarian index of rats in each group（mg/g.Mean±SD. n=12）

5 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清及卵巢組織中氧化應激水平的影響

如表4 和表5 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD 活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著減少（P＜0.05），GSH-Px 和SOD 活性顯著升高（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 1.Pathological changes of ovarian tissue sections（HE staining，scale bar=50 μm）.A：control group；B：model group；C：Diane-35 group；D：AST-L group；E：AST-H group.The ovaries of rats in groups B and D were enlarged，with pale sur?face，rare corpus luteum，and multiple cystic dilated follicles.圖1 各組大鼠卵巢組織切片病理觀察

表3 各組大鼠血清性激素水平比較Table 3.Comparison of serum levels of sex hormones in rats（Mean±SD. n=12）

6 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織中StAR 及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

如圖2 和表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 4.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in serum of rats in each group（Meas±SD. n=12）

表5 各組大鼠卵巢組織中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 5.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in ovarian tissue of rats in each group（Mean±SD. n=12）

Figure 2.The protein expression of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in ovarian tissue detected by Western blot.圖2 Western blot 檢測卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

討 論

OS 是由于機體自由基產(chǎn)生過多，自身清除自由基的能力下降，導致機體氧化和抗氧化失衡而引發(fā)的組織損傷。OS 不僅在慢性炎癥、腫瘤、老化及各種代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用，也與PCOS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。有研究報道［11］，OS 損傷可導致卵泡發(fā)育受損、成熟障礙和卵泡閉鎖；同時也有研究提出［12］，OS 可增強卵巢雄激素相關(guān)合成酶StAR 的表達，刺激雄性激素的產(chǎn)生和釋放，從而導致PCOS 發(fā)生。這些研究提示OS 可能是PCOS 的發(fā)病機制之一，減輕OS 可能是PCOS 治療的潛在方法。黃芪甲苷作為傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、擴血管和改善心腦缺血性疾病等作用［13］，但黃芪甲苷是否對PCOS 造成的氧化應激損傷以及性激素水平有一定的作用，尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷能通過下調(diào)PCOS大鼠機體的氧化應激水平，抑制StAR 的表達，調(diào)節(jié)血清性激素水平，減少卵巢組織細胞凋亡，從而發(fā)揮對PCOS模型大鼠的保護作用。

PCOS 是一種常見的排卵障礙性疾病，其卵泡發(fā)育異常主要表現(xiàn)為過多的早期卵泡生長。本研究結(jié)果顯示，PCOS 模型大鼠動情周期紊亂，卵巢指數(shù)顯著增加，卵巢組織形態(tài)學觀察結(jié)果表明，模型大鼠卵巢內(nèi)可見較多囊狀擴張卵泡，未見黃體，提示無排卵，與臨床PCOS 患者病理表現(xiàn)相符［14］，說明本研究成功建立了來曲唑誘導的PCOS大鼠模型，該模型的核心病理機制可能是由于卵泡不能發(fā)育成熟和卵泡壁的過度增生不能破裂，導致卵泡閉鎖造成的。給與高劑量黃芪甲苷治療后，模型大鼠動情周期恢復規(guī)律性變化，卵巢指數(shù)趨于正常，卵巢內(nèi)少見囊狀擴張卵泡，黃體有所恢復，提示黃芪甲苷能夠顯著改善PCOS 模型大鼠的排卵狀況。正常生理狀態(tài)下卵泡的生長發(fā)育在多種性激素的調(diào)控下精密有序地進行，包括T、LH、E2和FSH［15］。PCOS 患者通常表現(xiàn)出復雜的內(nèi)分泌異常，其中以高血清T 和LH 以及低血清E2和FSH 為主要特征［16-17］。本研究結(jié)果顯示，PCOS 大鼠血清T 和LH 含量顯著增加，而E2和FSH含量顯著減少，與前人研究一致。而給與高劑量黃芪甲苷治療后，模型大鼠血清T 和LH 含量下降，E2和FSH 含量回升，說明黃芪甲苷能夠顯著平衡PCOS模型大鼠的血清激素水平。

表6 各組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達水平Table 6.Relative protein expression levels of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in rat ovarian tissue in each group（Meas±SD. n=12）

OS 被認為是PCOS 的潛在誘因，OS 能加重高雄激素的發(fā)生，而高雄激素血癥被認為是PCOS的典型特征之一［18］。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可反映機體氧化損傷的程度；SOD 和GSH-Px 是兩種主要的抗氧化劑，在維持機體的氧化-抗氧化動態(tài)平衡中起著重要作用，可將其作為抗氧化能力的檢測指標。本研究結(jié)果顯示，PCOS模型大鼠血清及卵巢組織中均出現(xiàn)MDA 含量明顯升高，GSH-Px 和SOD 活性明顯降低的現(xiàn)象，與Seyyed 等［19］的研究結(jié)果一致，表明OS確實參與PCOS 進程的調(diào)控。高劑量黃芪甲苷治療后，PCOS 大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量明顯下調(diào)，GSH-Px 和SOD 活性明顯上升，提示黃芪甲苷治療能有效改善其氧化應激水平。卵泡顆粒細胞參與了卵巢卵泡的發(fā)育、成熟、閉鎖及卵巢性激素的正常分泌過程，其凋亡被認為是PCOS卵泡退化的根本原因［20］。本研究結(jié)果顯示，PCOS 模型大鼠卵巢組織中cleaved caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調(diào)，Bcl-2 蛋白顯著下調(diào)，而高劑量黃芪甲苷治療能逆轉(zhuǎn)這類凋亡蛋白的表達變化，說明黃芪甲苷能減少卵巢細胞的凋亡，改善PCOS癥狀。為進一步明確黃芪甲苷改善PCOS氧化應激損傷的具體靶點，本研究對各組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達水平進行了檢測，研究結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達明顯增加，高劑量黃芪甲苷處理后StAR 蛋白表達顯著減少。提示黃芪甲苷可通過抑制OS發(fā)生，減少StAR的表達，調(diào)節(jié)性激素水平，從而改善PCOS。

綜上所述，黃芪甲苷可通過發(fā)揮抗OS 功效，下調(diào)StAR 蛋白表達，調(diào)節(jié)血清性激素水平，緩解卵巢增生程度和病理改變，從而發(fā)揮對來曲唑致PCOS模型大鼠的保護和調(diào)節(jié)作用，為黃芪甲苷應用于治療PCOS提供了實驗基礎(chǔ)。