田 莉，陳 文，駱元斌，黃小玲

（甘肅省中醫(yī)院 1病理科，2足踝骨科，甘肅蘭州 730050）

宮頸癌是女性最為常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國女性惡性腫瘤中居第2 位［1-2］。持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papil?lomavirus，HR-HPV）是宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical in?traepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要原因［3］。E6 和E7 基因是HPV 癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物E6 和E7 蛋白是致癌的關(guān)鍵［4-5］。有研究表明，HPV DNA檢測并不能準(zhǔn)確反映HPV 感染后的活化狀態(tài)，而E6 和E7基因無論在HPV 游離或整合狀態(tài)均存在，是促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞惡變的重要分子［6-7］，因此檢測HPV E6/E7 mRNA對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的篩查和診斷要優(yōu)于HPV DNA 檢測。本研究通過回顧性統(tǒng)計HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA 病例的分析比較，初步探討兩者在篩查宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的應(yīng)用價值。

材料和方法

1 一般資料

回顧性收集2018 年10 月～2019 年10 月甘肅省中醫(yī)院病理科行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（ThinPrep cy?tology test，TCT）患者標(biāo)本共206 例，年齡22～73 歲，平均年齡42.13 歲，中位年齡42 歲，排除既往CIN史、自身免疫疾病史、妊娠史、子宮切除史，取材前3 d內(nèi)無性生活史。

2 實驗方法

2.1 TCT 使用TCT專用宮頸刷采集宮頸細(xì)胞樣本，采集宮頸表面及移行帶的宮頸脫落細(xì)胞，在細(xì)胞保存液瓶中漂洗后，放入全自動細(xì)胞制備儀器，通過混勻、過濾、轉(zhuǎn)移、貼附、巴氏染色后顯微鏡下觀察診斷。根據(jù)2001 年國際癌癥協(xié)會推薦的泊賽斯達(dá)系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）分類標(biāo)準(zhǔn)新改版（TBS-2014）進(jìn)行閱片判讀。結(jié)果分為：（1）未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性病變（no intraepithelial lesion or malignancy，NILM）；（2）意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypi?cal squamous cells of undetermined significance，ASCUS）；（3）低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；（4）不能除外高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squa?mous cells，cannot exclude high-grade squamous in?traepithelial lesion，ASC-H）；（5）高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。

2.2 HPV DNA 檢測 采用HC2 法檢測HPV DNA，使用化學(xué)發(fā)光檢測雜交信號放大技術(shù)，對14 種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）和5種低危型HPV（6、11、42、43和81）基因型進(jìn)行分型檢測。

2.3 HPV E6/E7 mRNA基因檢測 試劑盒和儀器均購自河南科蒂亞生物技術(shù)有限公司，采用bDNA法，針對14種高危HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）檢測，主要步驟包括裂解細(xì)胞、雜交捕獲mRNA、信號放大、底物發(fā)光反應(yīng)，經(jīng)Quanti-VirusTM冷光儀檢測光子數(shù)，計算機(jī)軟件轉(zhuǎn)換出HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)，自動判讀結(jié)果，拷貝數(shù)＞0為陽性。

2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 細(xì)胞學(xué)出現(xiàn)ASC-US以上結(jié)果的標(biāo)本，于陰道鏡下活檢，行病理組織學(xué)檢查，結(jié)果分為正常/炎癥、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變和鱗狀細(xì)胞癌。

2.5 免疫組化法檢測p16 表達(dá) 對活檢的標(biāo)本，同時使用小鼠抗人p16單克隆抗體，經(jīng)羅氏免疫組化自動系統(tǒng)染色，結(jié)果參照CINtec p16 結(jié)果判讀說明書。根據(jù)組織中陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，陽性結(jié)果為宮頸鱗狀上皮全層或基底層至副基底層的細(xì)胞呈連續(xù)彌漫著色（任何強(qiáng)度的連續(xù)彌漫著色均視為陽性），定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿；而宮頸鱗狀上皮不著色或孤立、小灶不連續(xù)的細(xì)胞著色均判讀為陰性結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；將組織學(xué)結(jié)果診斷為LSIL 及更嚴(yán)重結(jié)果的病例以靈敏度、特異度和陽性預(yù)測值對HPV E6/E7 mRNA、HPV E6/E7 DNA和p16檢測方法進(jìn)行性能比較。

結(jié) 果

1 標(biāo)本分組結(jié)果

將篩選的206 例患者行TCT 檢測，結(jié)果為NILM 93 例（45.1%），ASC-US 50 例（24.3%），LSIL 40 例（19.4%），ASC-H 7 例（3.4%），HSIL 16 例（7.8%）；HPV E6/E7 mRNA 檢測陽性為78 例（37.9%），HPV E6/E7 DNA 檢測陽性為99 例（48.1%）。將診斷結(jié)果為ASC-US 及更嚴(yán)重病變的113 例標(biāo)本行宮頸活檢并做病理組織學(xué)檢查及p16 免疫組化染色，結(jié)果顯示正常/炎癥20 例（17.7%），LSIL 53 例（46.9%），HSIL 33 例（29.2%），宮頸鱗狀細(xì)胞癌7 例（6.2%），p16陽性表達(dá)46例（40.7%）。

2 不同細(xì)胞病理學(xué)分級HPV E6/E7 mRNA 和DNA結(jié)果的對比情況

對NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H和HSIL這5種細(xì)胞病理學(xué)分級中HPV E6/E7 mRNA 和DNA檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA 的陽性率分別為22.6%、22.0%、70.0%、71.4%和81.3%（χ2=48.293），HPV E6/E7 DNA的陽性率為24.7%、54.0%、70.0%、85.7%和93.8%（χ2=46.053），均隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進(jìn)展呈遞增趨勢（P＜0.05）；在ASC-US 中，HPV E6/E7 mRNA 與HPV E6/E7 DNA 檢出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而在NILM、LSIL、ASC-H 和HSIL 中，兩者檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 不同細(xì)胞病理學(xué)分級HPV E6/E7 mRNA和HPV E6/E7 DNA檢出結(jié)果統(tǒng)計Table 1.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different cytopathological grades

3 不同組織病理學(xué)分級HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA結(jié)果的對比情況

將細(xì)胞病理學(xué)診斷結(jié)果為ASC-US 及更高級別病變的113 例標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)活檢并統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示正常/炎癥、LSIL、HSIL 及鱗狀細(xì)胞癌4種分級中HPV E6/E7 mRNA 的陽性率分別為20.0%、43.4%、69.7% 和100.0%（χ2=20.238），HPV E6/E7 DNA 的陽性率為30.0%、69.8%、78.8%和100.0%（χ2=18.164），均隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進(jìn)展呈遞增趨勢（P＜0.05）。由于鱗癌的例數(shù)較少（7 例），且兩者檢出率相同（陽性均為7/7，100%），故將HSIL 與鱗癌例數(shù)合并統(tǒng)計，結(jié)果顯示LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 與DNA 檢出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而正常/炎癥、HSIL 和鱗癌中兩者檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見表2。

表2 不同組織病理學(xué)分級HPV E6/E7 mRNA與HPV E6/E7 DNA檢出結(jié)果統(tǒng)計Table 2.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different histopathological grades

4 p16在不同組織病理學(xué)分級下檢出結(jié)果比較

對行組織學(xué)病檢的113例標(biāo)本同時做p16免疫組化染色，結(jié)果顯示正常/炎癥組未見p16 表達(dá)，LSIL、HSIL 及鱗癌組的陽性率分別為18.9%（10/53）、87.9%（29/33）和100.0%（7/7），隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進(jìn)展而增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。

5 HPV E6/E7 mRNA 和DNA 對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的診斷評估

以組織病理學(xué)結(jié)果（LSIL 及更嚴(yán)重病變）作為陽性結(jié)果，分別通過靈敏度、特異度和陽性預(yù)測值評估HPV E6/E7 mRNA 和DNA 對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的診斷價值。采用單個檢測及與p16 聯(lián)合檢測的方法，在統(tǒng)計與p16 聯(lián)合檢測時，將任何一項陽性定義為陽性結(jié)果（由于鱗癌樣本過少，與HSIL 組一起統(tǒng)計）。結(jié)果顯示，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，陽性預(yù)測值高于HPV E6/E7 mRNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 DNA，HPV E6/E7 mRNA+p16 特異度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 mRNA；在HSIL+鱗癌中HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，HPV E6/E7 mRNA+p16 特異度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 mRNA，而陽性預(yù)測值最高，見表3。

討 論

宮頸癌的發(fā)生與持續(xù)感染HR-HPV 有關(guān)［8-9］，HPV 可以感染宮頸基底層細(xì)胞，其DNA 游離在細(xì)胞核內(nèi)，通過整合到細(xì)胞染色體，導(dǎo)致癌變［10-11］。HPV大多數(shù)是一過性感染，可自行消退，只有1/3 病例呈持續(xù)狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體接觸致癌因素或免疫水平降低時，經(jīng)歷5～10 年會發(fā)展為CIN 和宮頸癌。目前，臨床使用TCT 與HPV DNA 檢測方法聯(lián)合篩查宮頸癌，由于大部分患者感染HPV后可通過自身免疫功能清除病毒［12］，病變惡化時間較長，因此HPV DNA 檢測方式對宮頸癌發(fā)生的預(yù)測過早，并不能反映病毒感染后的活化狀態(tài)［13］。而病毒整合到宿主細(xì)胞后，HPV E6和E7 癌基因過表達(dá)，分別通過結(jié)合抑癌蛋白p53 和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）等［14-15］，造成細(xì)胞周期紊亂，使被病毒感染的細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。因此有研究顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測更有助于判斷宮頸病變的進(jìn)展［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H 和HSIL 細(xì)胞病理學(xué)分級中HPV E6/E7 mRNA 和DNA的檢出率均隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進(jìn)展呈遞增趨勢（P＜0.05），且HPV E6/E7 mRNA 檢出率均低于HPV E6/E7 DNA 檢出率，在ASC-US 中兩者檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明HPV DNA 檢測確實不能反映HPV 整合活化的狀態(tài)，這與Johansson等［17］的研究結(jié)果相一致。

表3 不同檢測方法在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變效能對比Table 3.Comparison of efficiency of different detection methods in cervical squamous intraepithelial lesions（%）

本研究對ASC-US 及更高病變的病例行活檢及組織病理學(xué)診斷，結(jié)果顯示HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的檢出率隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進(jìn)展呈遞增趨勢，在LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 的檢出率低于HPV E6/E7 DNA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與細(xì)胞學(xué)結(jié)果一致，也從組織病理學(xué)角度說明HPV E6/E7 DNA檢測的是游離狀態(tài)下的DNA，陽性患者多數(shù)可能為一過性感染，易出現(xiàn)假陽性。

目前臨床治療CIN強(qiáng)調(diào)個體化，LSIL僅需隨診，不需手術(shù)，而HSIL 則需要臨床治療［18］，因此在診斷CIN 時出現(xiàn)一些需要注意的問題［19］：第4 版WHO（2014）女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類中將CIN 診斷分為LSIL 及HSIL，LSIL 包括CIN1、濕疣等，HSIL 包括CIN2、CIN3及鱗狀上皮原位癌。由于CIN2可能包含部分LSIL 及部分HSIL，籠統(tǒng)將CIN2 歸于HSIL，可能會導(dǎo)致HSIL擴(kuò)大化，臨床過度治療［11，18］，因此需要將這樣的情況再進(jìn)行區(qū)分。有研究表明，通過免疫組化染色檢測p16 的表達(dá)，對區(qū)別兩者有幫助。p16 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent ki?nases，CDKs）抑制劑，通過抑制CDK4 活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)p16基因突變，CDK4活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起細(xì)胞分裂加速，細(xì)胞惡性增殖［20-21］。在HPV 持續(xù)感染所致的高級別病變中，p16 呈連續(xù)大塊狀深棕色染色，而在低級別病變中，p16 一般為陰性（陰性或不連續(xù)灶狀陽性）［18］。本研究結(jié)果顯示，p16 的表達(dá)陽性率隨宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變級別的增高而增高，這與Gregg 等［22］和Kl?aes等［23］的研究結(jié)果一致。而本研究在檢測HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的同時加上p16 免疫組化染色，通過對敏感度、特異度和陽性預(yù)測值的統(tǒng)計，評估兩種檢測方法對宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的診斷價值，結(jié)果顯示，HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，HPV E6/E7 mRNA 特異度最高，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA 陽性預(yù)測值最高，而HSIL+鱗癌中HPV E6/E7 mRNA+p16陽性預(yù)測值最高，這也與目前的研究結(jié)果一致。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA 與HPV E6/E7 DNA 檢測相比，可以更好地反映HPV 的活化狀態(tài)，在篩查鱗狀上皮內(nèi)病變時，避免給患者帶來生理和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，而在診斷高級別病變時，為避免在臨床篩查時過度檢查與治療，可進(jìn)行p16 免疫組化染色，這樣更準(zhǔn)確地給予臨床參考依據(jù)，以便于臨床進(jìn)行個體化治療。由于本研究樣本數(shù)量較少，尤其是HSIL 病例收集不足，HPV E6/E7 mRNA 和DNA 兩種檢測方法在臨床診斷過程中應(yīng)該聯(lián)合采用還是在某種條件下單一采用，還需要更多臨床數(shù)據(jù)的驗證、支持以及進(jìn)一步的研究探討。