陳 麗 李影雄 孟泳錚 李敏霞 林偉強(qiáng) 蔡惠鈴 李紅梅

（1.廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510102）

代謝綜合征（MS）是一組以中心性肥胖、高血壓、血脂異常、糖耐量受損等集結(jié)發(fā)病為特征的臨床綜合征［1］。調(diào)查顯示，美國MS的患病率為25%［2］，中國MS的患病率為14%～17%［3］。而且隨著生活方式的改變和運(yùn)動(dòng)量減少，MS的發(fā)病率呈現(xiàn)直線上升的趨勢(shì)。MS是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病最重要的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重危害人類健康。MS是多種因素綜合作用的結(jié)果，胰島素抵抗是其最主要的病理基礎(chǔ)［4］。有研究顯示，過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ（PPAR-γ）通路、脂聯(lián)素（ADPN）、瘦素（LEP）等可以導(dǎo)致胰島素抵抗，并介導(dǎo)MS 的發(fā)生發(fā)展［5］。MS屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“痰濁”“血瘀”等范疇，其核心病機(jī)為痰瘀阻滯。山楂消脂膠囊是佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)山楂消脂膠囊可以降低MS患者的血脂、血糖、體質(zhì)量，改善胰島素抵抗［6-7］，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了MS大鼠模型，觀察山楂消脂膠囊對(duì)MS大鼠糖脂代謝的影響，并初步探討其防治MS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0008；基礎(chǔ)飼料，高脂高糖高鹽飼料（配方：基礎(chǔ)飼料56%、豬油15%、蔗糖15%、蛋黃10%、食鹽2%、膽固醇2%），飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試藥與儀器 山楂消脂膠囊（佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，粵藥制字Z20060045，批號(hào)20161105，規(guī)格0.35 g/粒），由佛山市中醫(yī)院藥方提供。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023370，規(guī)格0.5 g/片，10片/板，2板/盒，批號(hào)20160573）?？偰懝檀迹═C）（貨號(hào)ARB12489）、三酰甘油（TAG）（貨號(hào)K10255-AWE）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）（貨號(hào)SNM221-BES）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）（貨號(hào)SNM224-AHO）試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；空腹血糖（FBG）（貨號(hào)BJ3802）、血清胰島素（Fin）（貨號(hào)YX-C-B400）試劑盒購自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司；大鼠游離脂肪酸（FFA）（貨號(hào)JK-（EA）-11967）、過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ（PPAR-γ）（貨號(hào)MM-44573M1）、蛋白激酶（PKB）（貨號(hào)MM-0428R1）、磷脂肌醇-3激酶（PI3K）（貨號(hào)MM-0428M1）、ADPN（貨號(hào)MM-0553R1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號(hào)MM-0132M1）、LEP（貨號(hào)MM-0096R1）ELISA試劑盒均購自武漢益普生物科技有限公司；電子天平（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；TGL-15M臺(tái)式微量高速冷凍離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）；AU5800全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司）；HBS-1096C酶標(biāo)分析儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)（淮北軟隆生物科技有限公司）。

1.3 造模與分組 40只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，分為造模組30只與對(duì)照組10只。造模組大鼠參照夏燕萍等建立MS大鼠模型：予以高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)，劑量為每日20 g，分2次喂服。對(duì)照組予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，每日20 g，分2次喂服。造模時(shí)間為16周，造模期間所有大鼠均自由飲水［8］。MS模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：肥胖基礎(chǔ)上伴隨TAG升高、HDL-C降低、血壓升高、胰島素抵抗指數(shù)（IRI）升高4項(xiàng)中任意2項(xiàng)［9］。造模過程中造模組死亡3只，MS模型不達(dá)標(biāo)3只，對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)死亡。隨后將24只MS大鼠隨機(jī)分為模型組、山楂消脂膠囊組和二甲雙胍組，每組各8只。

1.4 干預(yù)方法 按照人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表，山楂消脂組予以山楂消脂膠囊220.5 mg/（kg·d）加2 mL的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃，二甲雙胍組予鹽酸二甲雙胍片157.5 mg/（kg·d）加2 mL的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃，對(duì)照組和模型組予以等體積的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃，每天灌胃給藥分2次進(jìn)行，總給藥時(shí)間為4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 每2周檢測(cè)大鼠的體質(zhì)量、血壓、體長，Lee's指數(shù)=體質(zhì)量（g）（1/3）×10/體長（cm）。末次給藥后，禁食不禁飲12 h，腹腔注射烏拉坦麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液，-70℃保存；分離腸系膜、附睪旁和腎周脂肪組織，濾紙吸干后稱重，并記錄。體脂比=（腹腔脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。血清指標(biāo)檢測(cè)：按照說明書檢測(cè)血清FBG、Fin、TC、TAG、LDL-C、HDL-C、FFA水平，并計(jì)算 IRI=（FBG×Fin）/22.5。ELISA檢測(cè)脂肪組織PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN、GLUT4、TNF-α、LEP水平：取適量大鼠腹腔白色脂肪組織，PBS反復(fù)清洗去除血液，稱重，將脂肪組織和PBS加入勻漿器后充分研磨，再利用超聲破碎。勻漿液經(jīng)5 000×g離心5 min后取上清液，采用ELISA法檢測(cè) PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN、GLUT4、TNF-α、LEP水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比水平比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，山楂消脂組體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠SBP、DBP、FBG、Fin、IRI比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組SBP、DBP、FBG、Fin、IRI明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，山楂消脂組SBP、DBP、FBG、Fin、IRI明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比水平比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組山楂消脂組二甲雙胍組n 8 8 8 8體質(zhì)量（g）460.24±36.87 586.37±49.85△482.34±67.12*467.86±57.12*Lee's指數(shù)312.52±29.54 376.98±31.42△326.72±28.75*319.21±34.12*腹腔脂肪質(zhì)量（g）10.12±1.02 17.65±1.34△12.34±1.54*11.24±1.43*體脂比（%）2.19±0.16 3.01±0.21△2.56±0.24*2.40±0.18*

表2 各組大鼠SBP、DBP、FBG、Fin、IRI比較（±s）

表2 各組大鼠SBP、DBP、FBG、Fin、IRI比較（±s）

組別對(duì)照組模型組山楂消脂組二甲雙胍組n 8 8 8 8 SBP（mmHg）132.42±16.87 168.42±16.42△134.25±12.37*135.39±18.54*DBP（mmHg）89.68±11.24 124.21±13.54△92.36±15.34*93.42±14.52*FBG（mmol/L）5.62±1.13 7.69±1.64△6.02±1.32*5.76±1.62*Fin（mIU/L）19.35±3.62 36.75±4.38△21.36±3.27*22.13±3.26*IRI 4.84±0.65 12.56±2.15△5.71±1.34*5.62±2.18*

2.3 各組大鼠TC、TAG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組TC、TAG、LDL-C、FFA明顯升高（P＜0.05），HDL-C明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，山楂消脂組TC、TAG、LDL-C、FFA明顯降低（P＜0.05），HDL-C明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠TC、TAG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s）

表3 各組大鼠TC、TAG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組山楂消脂組二甲雙胍組n 8 8 8 8 TC（mmol/L）2.26±0.31 2.98±0.27△2.41±0.28*2.31±0.25*TAG（mmol/L）0.64±0.12 0.91±0.17△0.72±0.21*0.65±0.15*HDL-C（mmol/L）2.06±0.24 1.23±0.18△1.87±0.25*1.92±0.27*LDL-C（mmol/L）0.54±0.08 1.35±0.16△0.62±0.13*0.58±0.12*FFA（μmol/L）176.85±24.62 268.75±46.28△186.237±34.52*180.36±24.76*

2.4 各組大鼠 PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN、TNF-α、LEP水平比較 見表4。與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、LEP明顯升高（P＜0.05），PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，山楂消脂組TNF-α、LEP明顯降低（P＜0.05），PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN明顯升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN、TNF-α、LEP水平比較（±s）

表4 各組大鼠PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN、TNF-α、LEP水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組山楂消脂組二甲雙胍組n 8 8 8 8 PPAR-γ（ng/mL）12.66±2.13 6.34±1.14△10.64±2.67*11.12±1.38*PKB（ng/mL）26.87±2.69 13.27±2.62△24.13±2.34*24.36±3.28*PI3K（ng/mL）15.37±1.24 8.36±1.37△13.62±1.84*13.72±1.39*ADPN（μg/L）146.35±12.52 102.36±18.61△134.28±16.81*136.57±19.38*TNF-α（ng/L）135.24±24.16 246.35±54.13△142.36±26.57*146.87±26.74*LEP（μg/L）3.46±0.24 6.84±1.35△3.89±1.18*3.72±1.64*

3 討 論

高血壓病、糖尿病、肥胖、血脂異常等MS核心成分是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病最主要的危險(xiǎn)因素，最終導(dǎo)致患者致死、致殘，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。因此，積極防治MS對(duì)減少心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。代謝綜合征屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“痰濁”“血瘀”范疇，其發(fā)病與后天飲食失調(diào)密切相關(guān)，由于飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚膩，脾失健運(yùn)，脾不散精，水谷精微轉(zhuǎn)化失常，痰濕內(nèi)生，阻滯血脈，瘀血內(nèi)生，痰瘀互阻，引起體內(nèi)代謝紊亂，發(fā)生MS。因此，治療上應(yīng)健脾助運(yùn)、化痰祛濕、活血化瘀。山楂消脂膠囊是佛山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要由山楂、大黃、半夏、甘草組成，方中山楂化積滯、健運(yùn)脾胃、散瘀行滯，大黃活血祛瘀，半夏燥濕化痰，甘草健脾助運(yùn)，以化痰濕。諸藥合用，共奏健脾化濕、活血化瘀之功。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，山楂消脂膠囊具有改善血脂、血糖，減輕體質(zhì)量等作用［6-7］。但是關(guān)于作用機(jī)制尚未闡明，因此本研究進(jìn)一步闡明山楂消脂膠囊改善MS患者糖脂代謝的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采取高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)方法誘導(dǎo)MS大鼠模型，12周后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比、SBP、DBP、FBG、Fin、TC、TAG、LDL-C、IRI、FFA、TNF-α、LEP 水平明顯升高，PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN水平明顯降低。結(jié)果表明模型組大鼠出現(xiàn)肥胖、血壓升高、血脂異常、血糖升高、胰島素抵抗等情況，MS模型建立成功。并且MS大鼠FFA、TNF-α、LEP水平升高，PPAR-γ、PKB、PI3K、ADPN降低，提示LEP、ADPN、PPAR-γ等在MS發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

PPAR-γ是調(diào)控脂肪因子和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的主要參與者，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗、促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化等方面具有重要的作用［10］。PPAR-γ可以促進(jìn)下游基因PI3K的表達(dá)，而PI3K可以促進(jìn)葡萄糖攝取和激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4，從而加強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)［11］。PI3K磷酸化后同時(shí)可以激活下游的PKB，促進(jìn)葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，改善胰島素抵抗［12］。TNF-α也是PPAR-γ的下游基因，TNF-α可以通過抑制胰島素受體酪氨酸激酶的激活、抑制脂肪組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4的表達(dá)、上調(diào)FFA的表達(dá)從而干擾葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致胰島素抵抗和MS［13］。而PPAR-γ可以抑制TNF-α的表達(dá)，從而改善胰島素抵抗。FFA是可以干擾糖脂代謝和抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)過山楂消脂膠囊處理后大鼠體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比、SBP、DBP、FBG、Fin、TC、TAG、LDL-C、IRI、FFA、TNF-α平明顯降低，PPAR-γ、PKB、PI3K水平明顯升高。結(jié)果提示山楂消脂膠囊可能通過上調(diào)MS大鼠PPAR-γ表達(dá)后，進(jìn)一步促進(jìn)PKB、PI3K的表達(dá)和抑制TNF-α、FFA的表達(dá)從而改善胰島素抵抗。

白色脂肪組織在調(diào)節(jié)糖脂代謝和胰島素抵抗具有重要的作用。LEP是脂肪組織分泌的一種重要蛋白，可以調(diào)節(jié)能量平衡。正常情況下，胰島素刺激脂肪組織LEP合成，進(jìn)一步抑制神經(jīng)肽Y分泌，從而減少攝食和增加能量消耗，而且LEP可以抑制胰島素分泌，減少胰島素抵抗。而肥胖患者由于脂肪堆積，導(dǎo)致LEP大量異常分泌，形成瘦素抵抗，導(dǎo)致其抑制胰島素分泌能力下降，形成胰島素抵抗和MS［15］。ADPN是脂肪組織分泌的另一種蛋白，可以調(diào)脂糖脂代謝，改善胰島素抵抗［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)過山楂消脂膠囊處理后大鼠體質(zhì)量、Lee's指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量、體脂比、SBP、DBP、FBG、Fin、TC、TAG、LDL-C、IRI、LEP水平明顯降低，ADPN水平明顯升高。結(jié)果提示山楂消脂膠囊可能通過上調(diào)MS大鼠ADPN表達(dá)和抑制LEP表達(dá)從而改善胰島素抵抗。

綜上所述，山楂消脂膠囊可能通過調(diào)節(jié)PPAR-γ信號(hào)通路，上調(diào)ADPN的表達(dá)和下調(diào)LEP的表達(dá)改善代謝綜合征大鼠的糖脂代謝和胰島素抵抗。