李宇思 謝慧 劉艷 李清韻 肖旭

變應(yīng)性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)，俗稱過敏性鼻炎，患病率為10%～25%，是由于機(jī)體針對變應(yīng)原產(chǎn)生過量的特異性IgE而誘發(fā)，導(dǎo)致鼻腔黏膜水腫、噴嚏、鼻癢、分泌物增多等一系列癥狀。變應(yīng)性鼻炎屬祖國醫(yī)學(xué)“鼻鼽”的范疇，目前臨床尚無特效藥治療，西醫(yī)主要使用抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素等治療[1]。中藥在預(yù)防和治療變應(yīng)性鼻炎中具有很大的優(yōu)勢和潛力。

防風(fēng)、辛夷是導(dǎo)師謝慧治療變應(yīng)性鼻炎的常用藥對，長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)該藥對的應(yīng)用能緩解變應(yīng)性鼻炎鼻塞、鼻癢、噴嚏、流清涕的癥狀，并能減少其發(fā)作。劉金壘等通過對治療變應(yīng)性鼻炎國家專利中藥復(fù)方的挖掘發(fā)現(xiàn)，治療變應(yīng)性鼻炎最多的對藥為防風(fēng)-辛夷[2]。防風(fēng)辛、甘，溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，功擅解表祛風(fēng)，勝濕，止痙。辛夷辛，溫，歸肺、胃經(jīng)，功擅散風(fēng)寒，通鼻竅。變應(yīng)性鼻炎的主要病機(jī)是肺氣虛弱，風(fēng)寒外襲[2]，防風(fēng)、辛夷合用，可增強(qiáng)祛風(fēng)散寒通鼻竅之用，但兩藥配伍治療變應(yīng)性鼻炎的藥效機(jī)制尚不明了，有待進(jìn)一步闡明，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對防風(fēng)-辛夷藥對治療變應(yīng)性鼻炎的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、作用機(jī)制等進(jìn)行初步探索，為后續(xù)研究提供依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1藥效成分收集篩選

以防風(fēng)、辛夷為研究對象，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)進(jìn)行化學(xué)成分的查詢及篩選[3]。選取口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[4]的化學(xué)成分作為潛在有效成分。

1.2藥效成分靶點(diǎn)預(yù)測

繼續(xù)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索防風(fēng)和辛夷的所有成分的靶點(diǎn)，并與已得到的潛在成分相映射，獲得潛在靶點(diǎn)，利用 Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和Uniprot 數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)將防風(fēng)和辛夷有效靶點(diǎn)與人類相關(guān)基因相對應(yīng)，獲得藥物的潛在靶點(diǎn)。

1.3疾病靶點(diǎn)預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca/)搜索“allergic rhinitis”，合并3個疾病數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值作為疾病候選靶點(diǎn)。在Unitprot數(shù)據(jù)庫中查詢靶點(diǎn)的基因名，對候選靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將藥物疾病映射的共同靶點(diǎn)與藥物的有效活性成分導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5獲取藥物與疾病的共同靶點(diǎn)

借助Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將藥物潛在靶點(diǎn)與疾病作用靶點(diǎn)取交集，獲得防風(fēng)-辛夷藥對治療變應(yīng)性鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.6構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用 STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，將藥對和疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人類物種(Homo sapiens)，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，檢索研究相關(guān)文獻(xiàn)，為確?？尚哦?，將交互分?jǐn)?shù)限定為>0.4，去除無相互作用的單一蛋白，獲得最終的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7GO功能、KEGG通路富集分析

在DAVID6.8數(shù)據(jù)平臺(https://david.ncifcrf.gov/)傳關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行GO分析[由細(xì)胞組成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)三部分組成]和KEGG分析，并通過微生信在線平臺分別繪制高級氣泡圖。

1.8構(gòu)建“成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用 Cytoscape 3.8.0 軟件對防風(fēng)、辛夷藥對預(yù)測的44個靶點(diǎn)及相對應(yīng)的32種化學(xué)成分，以及靶點(diǎn)相對應(yīng)的主要通路進(jìn)行分析，構(gòu)建核心藥物組合成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18原則，共篩選得到36種候選藥效成分，其中防風(fēng)18種，辛夷19種，其中共有成分1種，詳細(xì)信息如表1所示。36個有效成分經(jīng)進(jìn)一步搜集共得到潛在有效靶點(diǎn)80個，運(yùn)用Cytoscape3.8.0繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1 ，該網(wǎng)絡(luò)共包含111個節(jié)點(diǎn)，342條邊，其中34個節(jié)點(diǎn)代表藥效成分，77個節(jié)點(diǎn)代表與藥效成分相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

表1

圖1

2.2變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)的獲取及藥物與疾病交集靶點(diǎn)的獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫中搜集變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)2073個，考慮靶點(diǎn)基因過多，按Relevance Score分?jǐn)?shù)由高到低進(jìn)行排序，經(jīng)兩次篩選大于中位數(shù)的靶點(diǎn)后，獲939個靶點(diǎn)。結(jié)合Drugbank、OMIM數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)，合并去重，共獲得疾病靶點(diǎn)1147個。在Venny2.1.0中將篩選出的防風(fēng)-辛夷活性成分靶點(diǎn)與變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)取交集，得到44個共同關(guān)鍵靶點(diǎn)，為CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、SLC6A4、SLC6A3、PTGS1、PGR、NR3C2、PTGS2、GABRA2、IL6、PTGER3、TGFB1、TNF、CXCL8、CCL2、ADRB2、NOS2、FN1、CASP3、MMP1、NOS3、PIK3CG、MAPK14、ESR1、RELA、CASP8、PPARG、AKT1、JUN、BCL2、KDR、PRKCA、DPP4、PON1、HTR2A、RXRB、ADRA1A、AR、KCNH2、ESR2、PRKCD，見圖2。

圖2

2.3防風(fēng)-辛夷藥對治療變應(yīng)性鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

為了更好地分析靶點(diǎn)蛋白間的相互作用，將疾病和藥對的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，為確保數(shù)據(jù)的可靠性，選擇0.4的高置信度，繪制蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，去除無相互作用的單一蛋白，獲得最終的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包括44個節(jié)點(diǎn)，285條邊。根據(jù)Degree值篩選出排名前五的靶點(diǎn)分別是AKT1、IL6、NOS3、JUN、MAPK14。

2.4GO功能和KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步闡明關(guān)鍵靶點(diǎn)的可能作用，應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)平臺對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，共有321個GO術(shù)語條目，其中細(xì)胞組成27個，分子功能49個，生物過程245個，KEGG富集顯示92條通路。按P值排序后，取前20條通過通過微生信在線平臺分別繪制高級氣泡圖，見圖4。

圖3

圖4

GO功能富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞組成(CC)主要集中于質(zhì)膜(plasma membrane)、突觸(synapse)、膜筏(membrane raft)、質(zhì)膜的組成部分(integral component of plasma membrane)、突觸后膜(postsynaptic membrane)等部位，見圖4a；分子功能(MF)主要集中于酶結(jié)合(enzyme binding)、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、類固醇結(jié)合(steroid binding)等方面，見圖4b；生物過程(BP)主要集中于脂多糖介導(dǎo)的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)等方面，見圖4c。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、膽堿能突觸(Cholinergic synapse)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等20條通路與防風(fēng)-辛夷治療變應(yīng)性鼻炎可能相關(guān)，見圖4d。

2.5成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用 Cytoscape 3.8.0 軟件對防風(fēng)、辛夷藥對預(yù)測的44個靶點(diǎn)及相對應(yīng)的32種化學(xué)成分，以及靶點(diǎn)相對應(yīng)的主要通路進(jìn)行分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖5。

圖5

3 討論

防風(fēng)、辛夷中色原酮、5-O-甲維阿斯米醇、歐前胡素、木蘭脂素、Galgravin能匹配到較多的靶點(diǎn)，提示著可能是防風(fēng)、辛夷治療變應(yīng)性鼻炎的關(guān)鍵有效成分。歐前胡素可顯著抑制RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒，并降低組胺及各炎癥指標(biāo)的釋放，促進(jìn)IFN-γ表達(dá)，通過免疫調(diào)節(jié)降低細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]。色原酮能降低血清的IL-1β,IL-6和TNF-α水平,降低炎癥反應(yīng)[6]，從而減輕變應(yīng)性鼻炎的癥狀。5-O-甲維阿斯米醇能顯著抑制二甲苯引起的皮膚腫脹, 降低炎癥反應(yīng)[7]。木蘭脂素具有較強(qiáng)的抗過敏作用，對炎癥早起有明顯的抑制作用，其抗炎機(jī)制與其抑制IL—la的作用有關(guān)[8-9]。而Galgravin作為一種有效的抗PAF化合物[10]，對PAF導(dǎo)致的變應(yīng)性鼻炎可能具有較好的治療效果。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)表明，44個關(guān)鍵靶點(diǎn)中，IL6的連接度最高。IL-6是炎癥發(fā)生最關(guān)鍵的炎癥因子，在適應(yīng)性免疫和慢性炎癥等病理過程中起重要作用[11]。王鑫等[12]研究表明，IL6與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病密切相關(guān)，Kimura等[13]認(rèn)為IL-6增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的終末分化，放大IgE合成的信號，促使B淋巴細(xì)胞成熟為高效合成IgE的細(xì)胞，并最終分泌IgE。除此之外，AKT1、NOS3、JUN、MAPK14，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與多種生物過程，PI3K/AKT 信號通路可以抑制肥大細(xì)胞活性和變應(yīng)性鼻炎的變應(yīng)性反應(yīng)，而在此通路中，AKT 發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[14]。MAPK14參與調(diào)控T細(xì)胞受體、輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2、Th17細(xì)胞分化)信號通路從而參與機(jī)體免疫應(yīng)答[15]，并且參與細(xì)胞的生長分化過程[16]。JUN蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和分化，且涉及炎癥細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子和趨化因子的釋放[17]。NOS3的活性被抑制，可控制某些炎癥因子所介導(dǎo)的通透性增加[18]，從而減少滲出。

通過GO生物功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其可以通過影響酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、藥物結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、受體結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白酶活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、血管生成、突觸傳遞等的作用來治療變應(yīng)性鼻炎。KEGG 通路富集分析顯示了防風(fēng)-辛夷療變應(yīng)性鼻炎的主要信號通路。研究表明TLRs信號可能通過參與誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1和/或 Th2型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)過敏性炎癥[19-20]。鈣信號通路與變應(yīng)性鼻炎中的T細(xì)胞分化有關(guān)[21]。NOD樣受體信號通路能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起Th2細(xì)胞因子的釋放，加重或維持AR狀態(tài)，并且能增強(qiáng)免疫應(yīng)答[22]。因此，Toll受體信號通路、NOD樣受體信號通路、鈣離子通道可能是防風(fēng)-辛夷治療過變應(yīng)性鼻炎的的潛在靶信號通路。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對防風(fēng)-辛夷治療變應(yīng)性鼻炎的化學(xué)成分、靶點(diǎn)、通路之間進(jìn)行研究，體現(xiàn)了防風(fēng)、辛夷藥對多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。但防風(fēng)-辛夷藥對治療變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。