趙航宇，付海亮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外一科，黑龍江 哈爾濱 150080)

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是一種將動物或人全血經(jīng)過反復(fù)離心所獲得的多功能血小板濃聚物，其血小板濃度為生理血液中的3～5倍[1]。成分包括高濃度多種類的生長因子、纖維蛋白、白細(xì)胞及炎癥介質(zhì)等[2]，PRP具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、胞外基質(zhì)生成、抗炎等作用，目前已廣泛應(yīng)用于骨組織、軟骨組織、肌腱、韌帶、皮膚缺損、神經(jīng)損傷及美容、生發(fā)等的再生修復(fù)治療[3]。

外泌體(exosome)是一種雙層脂質(zhì)膜活性小泡，因來源細(xì)胞差異大小不一，變異范圍從30～100 nm到40～200 nm不等，是生物活性蛋白、脂質(zhì)、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)和微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)的載體[4]，在細(xì)胞間通訊及介導(dǎo)生物功能方面起至關(guān)重要的作用[5]。外泌體起源于胞內(nèi)早期內(nèi)小體(early endosome)，內(nèi)小體膜內(nèi)陷并發(fā)育成熟形成多囊體(multivesicular bodies，MVBs)，與質(zhì)膜融合后通過胞吐作用釋放[6]。生理?xiàng)l件下，幾乎所有代謝活躍的細(xì)胞均能釋放外泌體，并通過血液、淋巴液、腦脊液等體液系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體各處，可廣泛存在于血液、唾液、腦脊液、母乳、尿液等處[7]。有確鑿證據(jù)表明，外泌體具有與來源細(xì)胞相似的功能作用[7]，而組織損傷、缺氧等應(yīng)激條件，可影響相關(guān)細(xì)胞外泌體的成分組成及合成、分泌，進(jìn)而參與損傷修復(fù)等病理過程[8]。

血小板是沒有基因組DNA的無核細(xì)胞，但它含有豐富多樣的mRNA和miRNA，是人體循環(huán)血漿中外泌體的主要來源[9]，甚至有文獻(xiàn)報(bào)道，血小板源外泌體數(shù)量多達(dá)血清外泌體總數(shù)的70%，并參與炎癥和動脈粥樣硬化等多種重要病理生理機(jī)制[10]。富血小板血漿來源外泌體(exosomes derived from platelet rich plasma，PRP-exos)是通過過濾、離心等多種方法從PRP中提取獲得的血小板源外泌體，其大小、形態(tài)及部分蛋白標(biāo)記物與其他細(xì)胞的外泌體相似，同樣是細(xì)胞間通訊作用的主要媒介，不同的是血小板外泌體內(nèi)部含有更多的趨化因子、生長因子等活性物質(zhì)[11]。近年來，已有大量報(bào)道證實(shí)了PRP在促進(jìn)骨、軟骨等組織中的修復(fù)作用[12]，而PRP-exos在其中充當(dāng)著重要角色，據(jù)研究報(bào)道，PRP的組織修復(fù)活性可能是由于生長因子和其他生物活性分子的有效細(xì)胞間通訊作用所致，這些分子通過搭載于PRP-exos來介導(dǎo)[13]。

1 外泌體的生理特性

1.1 靶向性 外泌體本身具有一定的內(nèi)在靶向性，例如中樞神經(jīng)細(xì)胞來源的外泌體能通過血腦屏障靶向特定的神經(jīng)[14]，缺氧腫瘤細(xì)胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內(nèi)募集[15]，這種特性主要與其膜表面的蛋白相關(guān)。當(dāng)出現(xiàn)缺氧、損傷等刺激時(shí)，釋放至胞外的外泌體可作用于附近細(xì)胞，也可通過體液系統(tǒng)達(dá)到應(yīng)激部位靶細(xì)胞，通過膜表面配體-受體蛋白的相互識別與結(jié)合，外泌體膜與靶細(xì)胞膜融合并向胞漿內(nèi)釋放搭載物，這是最常見的外泌體-靶細(xì)胞作用方式[16]。

1.2 穩(wěn)定性和生物兼容性 除了具有更強(qiáng)的組織修復(fù)潛力，PRP-exos在穩(wěn)定性及生物兼容性等方面還具有明顯優(yōu)勢。一方面，外泌體雙層脂質(zhì)膜的包裹作用，可以保護(hù)所搭載的生長因子及遺傳物質(zhì)不被體內(nèi)降解酶及其他化學(xué)物質(zhì)影響，從而更好地發(fā)揮修復(fù)作用[17]。同時(shí)外泌體也存在針對免疫清除的主動識別避免機(jī)制，據(jù)報(bào)道，外泌體膜表面表達(dá)的CD47分子能保護(hù)外泌體遠(yuǎn)離單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，從而避免被清除[18]。另一方面，外泌體具有極低的免疫原性，治療中發(fā)生免疫排斥及發(fā)熱等不良反應(yīng)可能性更?。贿@也使得PRP-exos來源更加廣泛，不再局限于自體血，可直接利用臨床血庫的同種異體血，便于進(jìn)行規(guī)模量產(chǎn)及臨床治療；此外，PRP-exos為跨物種的治療及通訊提供了可能[19]，目前已有不少研究報(bào)道過PRP-exos用于跨物種治療的潛力[20-21]。

2 外泌體的提取與鑒定

在對PRP外泌體的研究中，必須提高外泌體的純度，排除細(xì)胞碎片、雜質(zhì)蛋白及其他納米大小胞外結(jié)構(gòu)的影響，從而保證生理特性及功能分析的準(zhǔn)確性。PRP-exos的提取包括PRP提取和外泌體提取兩部分。PRP的提取方法相對成熟，常用二次離心法，通過預(yù)離心去除大部分紅細(xì)胞、白細(xì)胞及其他血漿成分，包括Anitua法、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法等[12]。針對PRP外泌體的提取及鑒定方法目前尚無針對性研究報(bào)道，可參照其它外泌體的提取及鑒定方法，相關(guān)研究中常用的是Thery等[22]的差速超速離心法。Aatonen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，差速超速離心法提取的血小板外泌體中混有大量胞外體(ectosomes)，這可能是由于二者在直徑上存在部分重疊(一般來說，血小板外泌體直徑小于100 nm，而胞外體直徑為100～1 000 nm)，或者存在較大但較輕的胞外體和較小但密度較高的外泌體，離心步驟難以分離兩者。對此，20 000×g的離心步驟可以減少250～500 nm的胞外體數(shù)量，增加提取物中100 nm以下小泡的占比，從而提高外泌體的純度。

2.1 外泌體提取 常用的外泌體提取方法共6種，包括超速離心法、聚合物沉淀法、超濾法、免疫親和法、尺寸排阻色譜法和微流控技術(shù)[24]。這些提取技術(shù)存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，尤其在外泌體的純度上均存在不足，事實(shí)上采用現(xiàn)有技術(shù)制備的“外泌體樣品”不僅含有脂蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)，還包括大量的非外泌體小泡，如微泡、凋亡小體和胞體碎片[25]。

超速離心法目前應(yīng)用最廣泛，被認(rèn)為是外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)[26]，缺點(diǎn)在于設(shè)備昂貴，提取耗時(shí)。差速超速離心法通過反復(fù)的超速離心步驟，分離不同粒徑和密度的顆粒，最終獲得沉積的外泌體，可用于大量的外泌體提取，但獲得的外泌體可能存在脂蛋白和蛋白雜質(zhì)污染風(fēng)險(xiǎn)[26]；相比而言，蔗糖密度梯度離心法可獲得更高純度的外泌體[27]，但需要嚴(yán)格把控離心時(shí)間，對操作技術(shù)要求較高[24]。聚合物沉淀法具有高產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)，通過這種方法在尿液樣本中能提取保留更多的外泌體、miRNAs及mRNAs[28]，常用的聚合物添加劑為分子量6 000～20 000 Da的聚乙二醇[29]，在最近的報(bào)道中，水兩相體系(aqueous two-phase system，ATPs)通過加入聚乙二醇和右旋糖酐混合而成的添加劑，在普通實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件下15 min就可獲得回收率約70%的外泌體，盡管高粘度對后續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)有不利影響，ATPs法仍提供了一種快速、廉價(jià)的外泌體提取方法[30]。尺寸排阻色譜法早在外泌體發(fā)現(xiàn)之前就廣泛用于脂質(zhì)顆粒等大分子的分離，近幾年在外泌體的提取中應(yīng)用越來越多，這種方法能最大限度保留外泌體的結(jié)構(gòu)和功能完整性[31]，提取可重復(fù)性強(qiáng)，采集簡單，不需要額外預(yù)處理[32]。iZON公司在此基礎(chǔ)開發(fā)出自動外泌體分離系統(tǒng)(QEV)，該系統(tǒng)允許快速、精確、可擴(kuò)展和自動化的外泌體分離[33]。Takov等[34]最近將QEV和超速離心進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)QEV含有更高的外泌體數(shù)、外泌體蛋白和更強(qiáng)的標(biāo)記信號，但是存在過量的脂蛋白污染物。此外，近幾年還陸續(xù)報(bào)道了具有高效率的基于免疫親和力的微流控技術(shù)[35]、尺寸依賴的微流控技術(shù)[36]以及無接觸粒子分選機(jī)制(如彈性升力、聲學(xué)和介電泳)的微流控系統(tǒng)[37]。目前，微流控技術(shù)正通過將傳統(tǒng)的兩步程序(外泌體分離和定性)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)完整的一步過程，極大地改變了基于外泌體的診斷前景[38]。

2.2 PRP外泌體鑒定 目前外泌體的鑒定主要依靠形態(tài)、大小和蛋白標(biāo)記幾個(gè)表征，方法包括：(1)掃描電鏡。透射電子顯微鏡具有較高分辨率，通過形態(tài)學(xué)觀察，外泌體為30～200 nm的杯狀或球狀膜性結(jié)構(gòu)。(2)納米粒子追蹤分析儀。觀察波動的光照強(qiáng)度下樣品顆粒的布朗運(yùn)動，記錄運(yùn)動路徑，利用NanoSight等軟件，根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程計(jì)算濃度和尺寸分布。(3)蛋白標(biāo)記物鑒定。通常外泌體具有來源細(xì)胞的標(biāo)記物，典型的共性表面蛋白標(biāo)記物有腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG 101)蛋白、CD 9、CD 63、CD 81、熱休克蛋白等，而PRP來源外泌體還擁有血小板標(biāo)記物CD 41[13]。事實(shí)上，所有表征鑒定方法都不能達(dá)到100%特異性，甚至像CD 63和CD 81這樣的經(jīng)典外泌體標(biāo)記物也能在其他亞細(xì)胞器官找到[39]，因此需要聯(lián)合多種表征方法來增加鑒定的準(zhǔn)確性。

3 PRP外泌體的組織修復(fù)作用及機(jī)制

PRP-exos釋放至細(xì)胞外空間后，可以與靶細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)合和融合，或者被靶細(xì)胞吞噬，從而改變受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，這種結(jié)合作用由膜表面受體-配體蛋白的特異性識別介導(dǎo)[16，40]。PRP-exos的組織修復(fù)作用機(jī)制可能主要包括兩個(gè)方面：(1)其包裹富集有大量高濃度生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)以及血小板內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，成纖細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等[17]。研究發(fā)現(xiàn)PRP-exos生長因子遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于PRP，同體積情況下，其堿性成纖細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)和血小板源性生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)和TGF-β1的濃度分別是PRP的3.3倍、2.7倍和35.5倍[13]。這些生長因子之間相互協(xié)同，共同促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞的增殖分化及合成代謝，促進(jìn)胞外基質(zhì)及血管生成，改善前體細(xì)胞的趨化性，從而達(dá)到促進(jìn)損傷組織修復(fù)的作用[2]。(2)PRP-exos通過轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、mRNAs、miRNAs等活性物質(zhì)至受體細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的基因表達(dá)、蛋白翻譯及細(xì)胞功能特性來維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及周圍病損修復(fù)[41-42]?？傊?，PRP-exos可以減少缺血和壞死微環(huán)境中細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管形成，募集間充質(zhì)干細(xì)胞及修復(fù)細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，改善相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)組織修復(fù)。

3.1 骨組織修復(fù)作用 過去人們多關(guān)注于干細(xì)胞來源外泌體的功能及潛在機(jī)制的研究，但很少有研究報(bào)道血小板衍生外泌體的存在和作用。2014年，Torreggiani等[10]從PRP中分離出外泌體，并首次證明其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖遷移和成骨分化有潛在的促進(jìn)作用。這些PRP-exos作用于局部環(huán)境的干細(xì)胞和骨前體細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞，促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞向骨損傷處遷移、細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到促進(jìn)骨組織修復(fù)的作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，PRP-exos誘導(dǎo)BMSCs增殖分化的作用隨濃度增加而增加，而當(dāng)濃度超過50 μg/mL時(shí)，其誘導(dǎo)作用卻降低，說明PRP-exos的誘導(dǎo)促進(jìn)作用可能在一定范圍內(nèi)呈濃度或劑量依賴性。

2017年，Tao等[43]將PRP-exos(50 μg/mL)和氫化可的松單獨(dú)或聯(lián)合加入小鼠成骨細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)PRP-exos可促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)激素對三種細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)骨組織的維持再生，同時(shí)，PRP-exos還能提高runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx 2)、Ⅰ型膠原和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。其體外實(shí)驗(yàn)還顯示，血小板內(nèi)皮生長因子、堿性成纖細(xì)胞生長因子和血小板源性生長因子BB在PRP-exos中均有高表達(dá)，并有利于新血管的形成。將PRP-exos用于經(jīng)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死大鼠模型同樣發(fā)現(xiàn)了其對股骨頭血管的保護(hù)及骨密度、骨強(qiáng)度的維持，證明了PRP-exos對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死的預(yù)防作用。

3.2 軟骨組織修復(fù)作用 由于軟骨組織缺乏血管，軟骨細(xì)胞分裂增殖能力有限，關(guān)節(jié)軟骨始終暴露于機(jī)械負(fù)荷，尤其骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者還存在關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥因子的干擾，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)一直是再生醫(yī)學(xué)中的難題。Liu等[44]在近期研究中，報(bào)道了PRP-exos對OA模型腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等促炎因子釋放的抑制作用，并通過wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、遷移和抑制軟骨細(xì)胞凋亡。在經(jīng)過白細(xì)胞介素1β預(yù)處理的兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的PRP外泌體以及激活后的PRP，發(fā)現(xiàn)PRP-exos(50 μg/mL)及PRP(50 μg/mL)可顯著降低TNF-α水平，其中PRP-exos(50 μg/mL)作用最強(qiáng)，其次為PRP(50 μg/mL)，差異不顯著；PRP-exos(5 μg/mL)的抑制作用優(yōu)于PRP(5 μg/mL)。該研究還發(fā)現(xiàn)PRP-exos可通過wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡，而高濃度(50 μg/mL)的PRP-exos有更明顯的效果。

Liu等[44]還報(bào)道了PRP外泌體對OA的預(yù)防作用。研究將24只白兔隨機(jī)分為4組。對照組(非手術(shù)組)，每周注射一次生理鹽水，每周一次；OA模型組(手術(shù)組)，每周一次關(guān)節(jié)內(nèi)注射生理鹽水；OA+PRP-exos組(手術(shù)組)，每周1次關(guān)節(jié)內(nèi)注射100 μg/mL PRP-exos；OA+PRP組(手術(shù)組)，每周1次關(guān)節(jié)內(nèi)注射100 μg/mL PRP。用10%水合氯醛(4 mL/kg)注射致OA模型兔，行左膝手術(shù)，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶和前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板；6周后評估軟骨退化情況。結(jié)果顯示OA組關(guān)節(jié)軟骨表面有局灶性增生，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，邊界模糊。但骨關(guān)節(jié)炎組的異?，F(xiàn)象可被PRP-exos和PRP逆轉(zhuǎn)。前者的優(yōu)勢明顯大于后者。此外，PRP-Exos可逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎引起的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的下降和Wnt5a蛋白的上調(diào)。Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨基質(zhì)的主要纖維成分，而Wnt5a蛋白能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的增加，抑制Ⅱ型膠原的表達(dá)[45]，因此，PRP-exos對于關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)合成是有利的。

由此可得出結(jié)論，PRP-exos不僅可減少OA模型中促炎癥因子TNF-α的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，還可減少軟骨組織丟失，促進(jìn)軟骨的再生修復(fù)，逆轉(zhuǎn)OA損傷。并且PRP-exos的效應(yīng)與濃度相關(guān)，較高濃度的PRP外泌體具有更高的修復(fù)效應(yīng)，而較低濃度的PRP-exos(5 μg/mL)修復(fù)效應(yīng)差于高濃度PRP(50 μg/mL)，甚至與同等濃度的PRP相比優(yōu)勢并不顯著；這也從側(cè)面說明要充分發(fā)揮PRP-exos的修復(fù)作用可能需要一個(gè)適當(dāng)?shù)臐舛然騽┝?，濃度過高或過低都可能修影響修復(fù)效果；毋庸置疑的是，PRP-exos為OA及軟骨損傷提供了一種新的治療途徑。

3.3 慢性創(chuàng)面修復(fù)作用 在慢性創(chuàng)面修復(fù)愈合過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管再生是關(guān)鍵因素之一。文獻(xiàn)表明，血小板衍生生長因子或外泌體中的mRNA及miRNA與血管再生有著密切關(guān)系[46]。Guo等[47]將不同濃度PRP-exos和PRP分別加入成纖維細(xì)胞、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)二者均能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，其中PRP-exos組效果最顯著，在培養(yǎng)第3天、第5天時(shí)PRP-exos(50 μg/mL)對成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用較PRP-exos(5 μg/mL)并無明顯差異，但在第7天時(shí)前者細(xì)胞增值率顯著優(yōu)于后者，說明PRP-exos具有更強(qiáng)的成纖維、成血管能力，同時(shí)修復(fù)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間更長，這種持久的修復(fù)效應(yīng)可能與外泌體miRNA的細(xì)胞間通訊或干細(xì)胞誘導(dǎo)分化有關(guān)；而對微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，PRP-exos(50 μg/mL)在第3、5、7天均較為顯著，與PRP-exos共同培養(yǎng)6 h后，微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成了相對較長、較致密的血管樣結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。將PRP-exos海藻酸鈉水凝膠用于糖尿病大鼠的慢性創(chuàng)面治療，結(jié)果顯示，經(jīng)PRP-exos處理的創(chuàng)面內(nèi)血管面積和血管數(shù)目均顯著高于PRP組和對照組，其創(chuàng)面面積收縮效果在第3、7、14天等節(jié)點(diǎn)均最為顯著。

Xu等[48]將負(fù)載PRP-exos的殼聚糖/絲質(zhì)凝膠海綿用于糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的治療研究中也證實(shí)，PRP-exos單獨(dú)或聯(lián)合莪術(shù)多糖明顯加速了糖尿病大鼠的創(chuàng)面膠原蛋白合成和沉積、再上皮化以及皮膚血管生成，有助于傷口縮小，從而加快了糖尿病創(chuàng)面的愈合速度。

這些結(jié)果表明，PRP-exos不僅能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)創(chuàng)面膠原蛋白合成，還有助于新血管的形成和皮膚再上皮化，在皮膚創(chuàng)面愈合中有明顯的促進(jìn)作用。

4 小結(jié)與展望

PRP-exos擁有高濃度的生長因子、活性蛋白及多種RNAs等搭載物，在PRP的組織修復(fù)中擔(dān)任重要角色，同時(shí)也在細(xì)胞間通訊及介導(dǎo)生物功能上發(fā)揮重要作用，它不僅具有成骨、成軟骨、血管生成及創(chuàng)面修復(fù)等巨大的組織修復(fù)潛力，還擁有較高的穩(wěn)定性及生物兼容性，易于規(guī)模量產(chǎn)并投入治療等諸多優(yōu)勢，已被證實(shí)可逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素所致的股骨頭壞死，有益于慢性創(chuàng)面的愈合，還可減輕OA模型炎癥反應(yīng)并促進(jìn)軟骨再生，阻止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生進(jìn)展。

PRP-exos用于修復(fù)治療的方式是多樣性的，可直接靜脈注射，或以液態(tài)、凝膠狀態(tài)注射于缺損部位，也可聯(lián)合組織工程支架材料與缺損部位相契合[47-48]，而在聯(lián)合干細(xì)胞或聯(lián)合手術(shù)應(yīng)用方面也值得探索。雖然其組織修復(fù)的分子機(jī)制尚不完全清楚，但隨著研究的深入，PRP-exos有望被更多人肯定和接受，甚至替代PRP成為骨、軟骨組織及創(chuàng)面愈合等再生修復(fù)治療的新途徑。

然而，關(guān)于PRP-exos也存在諸多問題需要解決，在徹底探索PRP-exos的生理特性及功能分析前，提取外泌體仍需要一種更加高效、快捷的優(yōu)化方案。根據(jù)目前的研究報(bào)道，PRP-exos的組織修復(fù)作用雖效果明顯，但相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)量較少，需要更多報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)。另外，PRP-exos搭載的各種RNA片段在發(fā)揮細(xì)胞間通訊的同時(shí)，可能會導(dǎo)致靶細(xì)胞的基因突變。據(jù)報(bào)道，外泌體還與腫瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞存活、化療耐藥和早期轉(zhuǎn)移有關(guān)[49]。盡管PRP-exos已多次用于動物實(shí)驗(yàn)，且并未報(bào)道出現(xiàn)不良后果，但PRP-exos的生物安全性仍需長期、大量的研究來證實(shí)。