孫磊 董科明 翟羽 趙剛 劉翠 劉彥

隨著全球人口老齡化的快速進(jìn)展，老年性骨質(zhì)疏松患者呈現(xiàn)爆發(fā)式地增長［1］。骨質(zhì)疏松癥是種植修復(fù)的相對禁忌，骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行種植的成功率遠(yuǎn)低于普通人群。因此，防治骨質(zhì)疏松癥對于提高種植修復(fù)的成功率具有重要的臨床意義［2］。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物，如選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雙膦酸鹽類等，因其諸多的毒副作用限制了其廣泛的臨床應(yīng)用［3］。所以，人們迫切需要找到一種毒副作用小、安全性高的骨質(zhì)疏松癥治療藥物。鳶尾素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由運(yùn)動誘導(dǎo)產(chǎn)生的肌源性細(xì)胞因子，它在棕色脂肪組織中表達(dá)較高［4］。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，老年人血液中鳶尾素的濃度與其骨密度呈正相關(guān)［5］。而且，有動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鳶尾素能緩解老齡性骨質(zhì)疏松，提高其骨密度并改善骨結(jié)構(gòu)［6］。但是，鳶尾素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）骨向分化的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬以體外培養(yǎng)的老齡小鼠BMSCs為研究對象，觀察鳶尾素對BMSCs骨向分化的影響并深入探討其作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器18個月齡雄性清潔級C57BL/6J小鼠，購自HFK Bioscience。Irisin（美國Phoenix Pharmaceuticals）；α-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；青霉素、鏈霉素（中國國藥集團(tuán))；3-甲基腺嘌呤（3-MA;美國TargetMol公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（上海碧云天生物）；P62抗體（貨號：#5114;稀釋比例:1∶1000;Cell Signaling Technologies,美國）；LC3B抗體（貨號：Ab192890;稀釋比例:1∶2000;Abcam,英國）；BCA測定試劑盒（南京建成）；PVDF膜（美國Millipore公司）。

Herocell C1型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海潤度生物）；BCM-1000A型生物凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；5702R型低速離心機(jī)、Biophotometer核酸蛋白測定儀（德國艾本德公司）；Multiskan型酶聯(lián)儀（美國賽默飛·世爾公司）；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）；LW300LFT型正置熒光顯微鏡（北京測維光電儀器廠）。

1.2 全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs在無菌環(huán)境中鈍性分離老齡小鼠雙側(cè)脛骨表面附著的軟組織，然后將脛骨浸入PBS緩沖液中，剪除干骺端后暴露髓腔。使用PBS緩沖液反復(fù)沖洗髓腔，將沖出的骨髓液以400g×5min離心后棄上清液；再用5ml含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，接入25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：5%CO2，95%O2，100%飽和濕度），5天后全換液。待細(xì)胞鋪滿80%的瓶底面積時(shí)進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3 ALP活性定量檢測將第3代BMSCs以5.0×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，待細(xì)胞鋪滿75%的瓶底面積時(shí)，換為自行配制的成骨誘導(dǎo)液（在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入100ml/L胎牛血清、100nmol/L地塞米松、10nmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/L左旋維生素C）培養(yǎng)，同時(shí)加入0、10、50、100、200ng/mL的鳶尾素，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第1、3、5、7天檢測520nm處測量OD值。

1.4 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 將第3代細(xì)胞以6.0×106/孔的密度接種于24孔板，待細(xì)胞鋪滿75%的瓶底面積時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)24h。然后，將細(xì)胞分為3組：對照組、鳶尾素組、鳶尾素+3-MA（自噬抑制）組。先加3-MA（2.5mmol/L）預(yù)處理30min，然后加入鳶尾素。加藥后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后取各組細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗2遍后，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各樣本取50μg總蛋白，上樣于PAGE膠后電泳。電泳后220mA,2h轉(zhuǎn)膜于0.2μm的PVDF膜上，室溫封閉2h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2h，最后用化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影。采用Image J軟件分析膠片灰度值。

1.5 qPCR檢測成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后提取細(xì)胞的總RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3min，96℃變30s，58℃退火30s，73℃延伸45s，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后73℃延伸10min。檢測成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Osx）、ALP、Ⅰ型膠原（COL-I）、護(hù)骨素（OPG）、骨橋蛋白（OPN）和骨鈣素（OCN）等成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)?；蛞镄蛄袇⒄找酝墨I(xiàn)報(bào)道［7］。

1.6 ALP染色 各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，進(jìn)行染色并拍照。具體步驟如下：①棄培養(yǎng)液。使用PBS緩沖液將細(xì)胞漂洗3遍后，采用細(xì)胞固定液固定30s；②加入染色液室溫下避光染色15min，自來水沖洗；③中性紅溶液復(fù)染2min，自來水沖洗干凈后拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。除特殊標(biāo)注外，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。對計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，如果方差齊，則采用LSD法進(jìn)行進(jìn)一步比較;如果方差不齊，則采用Tamhane′s T2法進(jìn)行進(jìn)一步比較。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene′s檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，如果P＜0.05（雙側(cè)）則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 老齡小鼠BMSCs形態(tài)觀察 老齡小鼠BMSCs原代培養(yǎng)3天時(shí)便有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。1周后貼壁生長細(xì)胞數(shù)明顯增多，有呈集落樣生長的趨勢。約10天時(shí)，細(xì)胞可鋪滿80%的瓶底面積，開始按1∶2比例進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞增殖加快，4-6天即可長滿瓶底面積的80%（圖1）。

2.2 ALP活性定量 為了獲取鳶尾素對老齡小鼠BMSCs骨向分化影響的最適干預(yù)濃度，首先進(jìn)行了劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鳶尾素可呈濃度依賴性地增加老齡鼠BMSCs的ALP活性，而且100ng/mL鳶尾素與200ng/mL鳶尾素增加ALP活性的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。因此，本研究選擇100ng/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。

表2 Irisin對老齡小鼠BMSCs的ALP活性影響

2.3 鳶尾素對老齡小鼠BMSCs骨向分化時(shí)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示：在老齡小鼠BMSCs骨向分化的過程中，鳶尾素顯著降低P62蛋白的表達(dá)，同時(shí)明顯升高LC3BII的表達(dá)，這提示鳶尾素能夠激活老齡鼠BMSCs的自噬活性。當(dāng)加入特異性自噬抑制劑3-MA后，鳶尾素激活老齡小鼠BMSCs自噬的作用明顯減弱（圖2）。

圖2 Irisin對老齡鼠BMSCs自噬相關(guān)蛋白P62和LC3B表達(dá)的影響Vehicle,對照組。Irisin,鳶尾素組。Irisin+3-MA，自噬抑制組。LC3BII,14 kDa。*表示與Vehicle組比較P＜0.05，#表示與Irisin組比較P＜0.05。

2.4 鳶尾素對老齡小鼠BMSCs骨向分化時(shí)成骨基因表達(dá)水平的影響 如圖3所示：在BMSCs成骨分化的過程中，與對照組比較，鳶尾素能顯著促進(jìn)成骨相關(guān)基因Runx2、Osx、ALP和COL-I的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（P＜0.05）;并且當(dāng)自噬被抑制后，鳶尾素提高Runx2、Osx、ALP和COL-I表達(dá)水平的作用減弱、消失。

圖3 BMSCs成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平Vehicle,對照組。Irisin,鳶尾素組。Irisin+3-MA，自噬抑制組。*表示與Vehicle組比較P＜0.05，#表示與Irisin組比較P＜0.05。

2.5 ALP染色 對各組BMSCs成骨誘導(dǎo)7天后行ALP染色，結(jié)果如圖4所示：與對照組相比，鳶尾素組可見廣泛交織的藍(lán)染區(qū)域;當(dāng)加入3-MA特異性地抑制自噬后，鳶尾素促進(jìn)ALP蛋白表達(dá)的作用明顯減弱。

圖4 ALP染色Vehicle,對照組。Irisin,鳶尾素組。Irisin+3-MA，自噬抑制組。圖中紅色箭頭示染色陽性的細(xì)胞，標(biāo)尺=100μm。

3.討論

本研究以老齡小鼠BMSCs為細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在成骨分化的過程中，鳶尾素既能提高BMSCs的ALP活性，又能上調(diào)成骨相關(guān)基因，并且證明鳶尾素促進(jìn)BMSCs骨向分化與激活自噬活性有關(guān)。

自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的、真核細(xì)胞所特有的程序化降解途徑，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)某些長壽蛋白和受損細(xì)胞器的降解［8］。自噬是普遍存在于各種真核生物生命過程中用以清除多余的或受損的生物大分子的重要機(jī)制，生物體借此維持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，這一過程在清除細(xì)胞內(nèi)廢物、組織重構(gòu)和生長發(fā)育中都起著極為重要的作用［9，10］。在機(jī)體衰老的進(jìn)程中，自噬活性下調(diào)［11］。近期有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，自噬也是維持干細(xì)胞的干性和分化能力所必需的［12］。在骨衰老的過程中，自噬調(diào)控BMSCs的特征和衰老［12］。而且，自噬可以幫助干細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷［13］。因此，本研究推測鳶尾素促進(jìn)BMSCs骨向分化可能與重新激活自噬有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鳶尾素顯著降低P62的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)提高LC3B-II的蛋白表達(dá)水平。P62蛋白連同其結(jié)合的多泛素化蛋白一同融合到自噬體中，當(dāng)自噬體與溶酶體形成自噬溶酶體后，這些蛋白均在自噬溶酶體中降解。所以，P62蛋白可被看作是自噬的一種底物。LC3B存在兩種可轉(zhuǎn)化的形式：LC3B-I和LC3B-II。細(xì)胞中新合成的LC3B以可溶的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，稱為LC3B-I。自噬激活時(shí)，LC3B-I可被泛素化修飾并與自噬體的膜融合，此時(shí)，以膜結(jié)合形式存在的LC3B稱為LC3B-II。LC3B-II存在于前自噬體和自噬體中，其數(shù)量與自噬體膜的數(shù)量呈正相關(guān)。所以，細(xì)胞中LC3B-II的數(shù)量在某種程度上可間接反應(yīng)細(xì)胞的自噬狀態(tài)［14］。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在骨向分化的過程中，鳶尾素可提高老齡小鼠BMSCs的自噬活性。

為了反證自噬在鳶尾素促進(jìn)BMSCs骨向分化中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用自噬特異性抑制劑3-MA抑制自噬。結(jié)果表明，當(dāng)自噬被抑制后，鳶尾素上調(diào)BMSCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用顯著減弱。Runx2和Osx是成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子［15，16］，Runx2和Osx的轉(zhuǎn)錄表達(dá)啟動后能促進(jìn)下游成骨相關(guān)蛋白ALP、COL-Ⅰ、OPG、OPN和OCN等表達(dá)。ALP和COL-I是成骨早期的標(biāo)志蛋白，而OPG、OPN和OCN則是晚期礦化的標(biāo)志物［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在骨向分化過程中，鳶尾素能顯著上調(diào)老齡鼠BMSCs中Runx2、Osx、ALP和COL-I的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。并且在抑制自噬后，鳶尾素的促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)的作用顯著減弱。在ALP染色實(shí)驗(yàn)中，再次驗(yàn)證了抑制自噬后，鳶尾素的促進(jìn)ALP表達(dá)的作用顯著減弱。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果某種程度上證明了鳶尾素促進(jìn)老齡鼠BMSCs成骨分化至少部分是通過激活自噬實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，鳶尾素對OPG、OPN和OCN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無顯著影響。這可能是因?yàn)椋罕緦?shí)驗(yàn)進(jìn)行qPCR的時(shí)間是在成骨誘導(dǎo)后第3天，此時(shí)正處于BMSCs成骨分化早期階段，晚期成骨分化標(biāo)志蛋白OPG、OPN和OCN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)還不明顯［7］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素能夠在體外促進(jìn)老齡鼠BMSCs骨向分化，并且鳶尾素的這種作用與激活自噬有關(guān)。應(yīng)用鳶尾素可能是臨床上改善老年性骨質(zhì)疏松患者種植區(qū)骨量不足的一種潛在的治療手段。