郭彤彤 朱銘強(qiáng) 李晉鵬 郭新榮 賀 虹

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 西部森林生物災(zāi)害治理國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 楊陵 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院 楊陵 712100)

杜仲(Eucomniaulmoides)是僅存于我國的第三紀(jì)孑遺植物，也是中國特有的重要經(jīng)濟(jì)樹種，其樹皮、葉、花及其次生代謝物均是重要的藥用資源(張康健等， 2009)。同時，杜仲葉、樹皮和種子中富含的白色絲狀杜仲膠是一種天然高分子物質(zhì)“反式聚異戊二烯”，具有熱塑性、熱彈性和高彈性，廣泛應(yīng)用于交通、通訊、醫(yī)療、電力、國防等領(lǐng)域(嚴(yán)瑞芳， 1995)。橡膠工業(yè)是國民經(jīng)濟(jì)最為重要的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)之一，而我國天然橡膠資源嚴(yán)重短缺。杜仲膠是除橡膠樹(Heveabrasiliensis)之外世界上唯一具有開發(fā)前景的優(yōu)質(zhì)天然橡膠資源，成為我國重要且緊缺的戰(zhàn)略物資。因此，大力培育杜仲資源，促進(jìn)杜仲膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對于提升和優(yōu)化我國橡膠原材料結(jié)構(gòu)具有重要的戰(zhàn)略意義。

一般認(rèn)為杜仲是比較抗蟲的樹種，但是隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，一種專門取食杜仲葉片的害蟲杜仲夢尼夜蛾(Orthosiasongi)(鱗翅目： 夜蛾科Noctuidae)暴發(fā)成災(zāi)，其食性專一，食葉量大，蔓延擴(kuò)散快，為害期長，目前已成為杜仲產(chǎn)業(yè)最具威脅的生物災(zāi)害之一(李劍豪等， 1997； 趙陽等， 2015)。杜仲夢尼夜蛾幼蟲能夠取食消化杜仲葉片，完成正常的生長發(fā)育，并將杜仲膠隨糞便排出(王俊雅等， 2016； 2017； 孫志強(qiáng)等， 2016)，而一些其他食葉昆蟲如銀杏大蠶蛾(Dictyoplocajaponica)僅可取食少量杜仲葉，長時間飼喂后幼蟲不能正常發(fā)育，出現(xiàn)消化不良和死亡。因此，杜仲夢尼夜蛾幼蟲消化道應(yīng)該具有適應(yīng)寄主和消化/降解杜仲膠的特殊代謝機(jī)制。

已知棲息于昆蟲消化道的微生物參與宿主許多重要的生理活動，如調(diào)節(jié)代謝、解毒、提供營養(yǎng)、激發(fā)免疫反應(yīng)、影響宿主昆蟲選擇行為和對環(huán)境的適應(yīng)性等(郭軍等， 2015； Paniaguaetal., 2018)。尤其在鱗翅目昆蟲中，其腸道微生物的主要功能是協(xié)助宿主代謝，幫助降解食物中難消化成分、有毒或有害物質(zhì)(陳勃生等， 2017)。那么，杜仲夢尼夜蛾幼蟲能夠取食和利用含膠的杜仲葉片是否與其腸道微生物有關(guān)，腸道微生物對其幼蟲生長發(fā)育和營養(yǎng)利用產(chǎn)生何種影響，能否利用腸道微生物進(jìn)行杜仲膠的提取，這些都是亟待研究的科學(xué)問題。

本研究對杜仲夢尼夜蛾幼蟲消化道的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與分子鑒定，并測定這些菌株對生物大分子物質(zhì)(纖維素、果膠和淀粉)和杜仲葉主要成分的降解能力，然后通過抗生素處理分析腸道菌群對其幼蟲生長發(fā)育和營養(yǎng)利用的影響，研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究杜仲夢尼夜蛾與寄主的協(xié)同進(jìn)化、害蟲防治及資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲源采集及消化道解剖

2017年6月，從陜西省漢中市略陽縣杜仲林采集杜仲夢尼夜蛾幼蟲，選取健康的6齡幼蟲，饑餓2 h后進(jìn)行消化道的解剖。解剖前，先將幼蟲放置于冰箱(-15 ℃)冷凍至昏迷，取出后浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中進(jìn)行體表消毒2 min，經(jīng)無菌水漂洗3次后，在解剖鏡(德國萊卡EZ4D)下小心解剖出完整的消化道。所有解剖均在超凈工作臺完成，所用工具經(jīng)嚴(yán)格濕熱滅菌。將解剖出的單個消化道放入1.5 mL滅菌的離心管中，加入1 mL無菌水研磨混勻，制成腸液備用。重復(fù)5頭幼蟲。

1.2 腸道細(xì)菌的分離培養(yǎng)和分子鑒定

采用平板法在LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)和大豆蛋白胨培養(yǎng)基(TSA)上進(jìn)行腸道細(xì)菌的分離培養(yǎng)(馬樂好等， 2005)。吸取制備好的腸液50 μL涂平板，每種培養(yǎng)基每頭幼蟲各重復(fù)3個平板。將培養(yǎng)平板倒置放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天觀察記錄菌落數(shù)量和形態(tài)。用接種環(huán)挑取大小、顏色、形態(tài)不同的單菌落，在新的LB平板上劃線培養(yǎng)，得到純的單克隆菌株。

對菌株進(jìn)行分子鑒定，首先將純化的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上(30 ℃，150 r·min-1)培養(yǎng)48 h，從每個菌株吸取2 mL菌液于新的離心管中進(jìn)行離心(12 000 r·min-1，2 min)； 棄上清，在沉淀中加入500 μL無菌水，混勻后放入金屬浴(95 ℃)中10 min，然后12 000 r·min-1離心2 min，上清液作為PCR模板備用。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系： Mix 12.5 μL，引物(10 μmol·L-1) 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，達(dá)到測序的濃度和純度后送奧科鼎盛生物公司進(jìn)行測序。

將獲得的菌株DNA序列進(jìn)行人工校對后，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，下載相似性最高的相關(guān)微生物序列，然后利用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多重比對，并采用MEGA 6.0 軟件基于最理想的建樹模型構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(Maximum likelihood tree)。相關(guān)菌株的DNA序列已上傳 GenBank，序列號為MK571186-MK571195。

1.3 腸道細(xì)菌對纖維素、果膠和淀粉的降解作用

為了分析10株細(xì)菌對生物大分子的降解能力，挑取其單菌落加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中富集12 h，然后各吸取1 mL菌液分別接種于20 mL分別含有纖維素、果膠、淀粉的液體培養(yǎng)基中(夏曉峰， 2014； 薛志靜等， 2017)。將以上液體培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，30 ℃培養(yǎng)3天，以不加菌的培養(yǎng)基作為對照。分別于培養(yǎng)24、36、48、60、72 h時吸取菌液2 mL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL，釆用二硝基水楊酸法(DNS比色法)，使用紫外可見分光光度計(jì)(島津UV-2450)檢測波長為550 nm下的吸光值。測定數(shù)據(jù)采用Excel和Origin軟件進(jìn)行分析和作圖。

1.4 腸道細(xì)菌對杜仲葉成分的影響

采集新鮮的杜仲葉晾干后粉碎，稱取10 g杜仲粉放入燒杯中，加入1 000 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁盅b入10個50 mL三角瓶(各裝20 mL)中高壓滅菌(121 ℃，15 min)，即得杜仲液體培養(yǎng)基。分別在杜仲液體培養(yǎng)基中接入前期富集好的10株細(xì)菌液1 mL，不加菌的杜仲葉溶液作為對照，30 ℃培養(yǎng)，72 h后各吸取樣品2 mL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清夜用0.22 μm濾膜過濾，取濾液在高效液相色譜儀(日立L2000)上檢測，比較分析接菌前后杜仲葉成分變化。

色譜條件： 色譜柱，Kromasil 100-5C18250 mm × 4.6 mm； 流動相A為0.1%磷酸，流動相B為甲醇； 流速1 mL·min-1； 檢測波長200～400 nm； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序： 0～6 min，A(%)6～6，B(%)94～94； 6～13 min，A(%)6～13，B(%)94～87； 13～22 min，A(%)13～20，B(%)87～80； 22～30 min，A(%)20～24，B(%)80～76； 30～45 min，A(%)24～35，B(%)76～65； 45～46 min，A(%)35～45，B(%)65～55； 46～60 min，A(%)45～50，B(%)55～50。

1.5 抗生素處理對杜仲夢尼夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

為了揭示腸道菌群對杜仲夢尼夜蛾幼蟲生長和發(fā)育的影響，采用抑菌圈法和微量肉湯法，參照CLSI 藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI, 2012a; 2012b)，從10種抗生素(慶大霉素、紅霉素、鏈霉素、氯霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、克拉霉素)中篩選出最適的抗生素及其濃度，確定1 μg·mL-1的氯霉素可基本清除幼蟲的腸道細(xì)菌。

收集產(chǎn)卵時間一致的卵塊放置于培養(yǎng)皿中，獲得孵化期一致的初孵幼蟲。將初孵幼蟲放置于玻璃試管(φ=10 mm)中，每管2頭，共30管。將新鮮的杜仲葉用1 μg·mL-1氯霉素浸泡10 min，晾干后用打孔器(φ=10 mm)打成圓片，稱重后飼喂15管幼蟲，作為處理組； 用無菌水浸泡過的杜仲葉圓片飼喂另外15管幼蟲，作為對照組。

每天定時進(jìn)行觀察、測量和稱質(zhì)量，分別記錄幼蟲的發(fā)育歷期、體長、頭寬、幼蟲體質(zhì)量、排糞量和取食量。按照以下公式計(jì)算各個營養(yǎng)指標(biāo)(Thakuretal., 2016)：

幼蟲相對生長率(RGR)=G/(B×T)；

消耗指數(shù)(CI)=I/(B×T)， 食物利用率(ECI)=G/I；

食物轉(zhuǎn)化率(ECD)=G/(I-F)， 近似消耗率(AD)=(I-F)/I。

式中，G為蟲體質(zhì)量增加值(即G=飼后幼蟲質(zhì)量-飼前幼蟲質(zhì)量)；I為幼蟲的取食量(即I=飼前食物質(zhì)量-飼后食物質(zhì)量)；F為糞便質(zhì)量；B為試驗(yàn)期間幼蟲的平均體質(zhì)量，B=(飼前幼蟲質(zhì)量+飼后幼蟲質(zhì)量)/2；T為試驗(yàn)天數(shù)。

用Excel和SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲夢尼夜蛾幼蟲消化道可分離培養(yǎng)的細(xì)菌種類

利用3種培養(yǎng)基，從杜仲夢尼夜蛾腸道中分離到10種不同形態(tài)的菌落，提取它們的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，得到其16S rRNA基因序列。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(表1)和構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，結(jié)果表明，它們屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)的10個屬的細(xì)菌，分別是短波單胞菌屬(Brevundimonas)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、莫拉菌屬(Moraxella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。

圖1 杜仲夢尼夜蛾腸道可分離培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of culturable bacteria isolated from the larval guts of O. songi采用軟件 MEGA 6.0 中的最大似然法構(gòu)建而得的系統(tǒng)發(fā)育樹，模型為K+2G，自展值為1 000； 標(biāo)尺0.05表示核苷酸位點(diǎn)的平均替代數(shù)。The phylogenetic tree was generated using the Maximum Likelihood method with 1 000 bootstraps and K+2G model on MEGA6.0 software. The scale bar represents 0.05 substitution per nucleotide position．

表1 杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌的分離鑒定Tab.1 Isolation and identification of bacteria from the larval guts of O. songi

圖2 杜仲夢尼夜蛾腸道分離細(xì)菌對纖維素(A)、果膠(B)和淀粉(C)的降解能力Fig.2 Biodegradation activity of the gut bacteria isolated from the larvae of O. songi on cellulose(A), pectin(B), and starch(C)

圖3 杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌對杜仲葉化學(xué)成分的影響Fig.3 Effects of gut bacteria isolated from larval guts of O. songi on chemical constituents of E. ulmoides leaves

2.2 腸道細(xì)菌對纖維素、果膠和淀粉的降解作用

采用DNS法測定幼蟲腸道細(xì)菌對淀粉、纖維素和果膠的降解作用，結(jié)果表明10株細(xì)菌對3種大分子物質(zhì)降解能力存在差異(圖2)。

將10株菌分別加入纖維素培養(yǎng)液后，菌株NT7吸光值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明該菌株可在較短時間內(nèi)分解完培養(yǎng)液中的纖維素，具有很強(qiáng)的降解能力； 8個菌株(LT1、NT2、NA3、NT4、NA5、NA6、NA8和NA9)的吸光值均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，表明培養(yǎng)液中還原糖含量不斷上升，菌株在測定時間內(nèi)仍未完全降解纖維素，降解能力相對較弱； 菌株NT10的吸光值一直呈遞減趨勢，表明其只消耗了培養(yǎng)液中原有的單糖，但沒有降解纖維素生成新的單糖，無降解纖維素的能力(圖2A)。

將10株菌分別加入果膠培養(yǎng)液后，6個菌株(NT2、NT4、NA5、NA6、NA8和NT10)的吸光值趨勢表現(xiàn)為先上升后下降，對果膠具有較強(qiáng)的降解能力； 菌株LT1的吸光值呈現(xiàn)一直上升趨勢，對果膠的降解能力相對較弱； 菌株NA3與NT7表現(xiàn)為吸光值持續(xù)下降，對果膠無降解能力(圖2B)。

在淀粉培養(yǎng)液中加入菌液后，10株菌均有降解淀粉的能力，其中，6個菌株(LT1、NT2、NA3、NT4、NA5和NA6)的吸光值表現(xiàn)為先上升后下降，降解淀粉的能力較強(qiáng)； 4個菌株(NT7、NA8、NA9和NT10)的吸光值持續(xù)上升，降解淀粉的能力相對較弱(圖2C)。

因此，10個菌株中，菌株NT10(微桿菌)對纖維素?zé)o降解作用，菌株NA3(不動桿菌)與菌株NT7(短波單胞菌)對果膠無降解作用，其余菌株均對纖維素、果膠和淀粉具有一定的降解能力。

2.3 杜仲夢尼夜蛾腸道細(xì)菌對杜仲葉成分的影響

在杜仲葉培養(yǎng)液中加入腸道細(xì)菌后，進(jìn)行高效液相色譜分析。結(jié)果顯示(圖3)，在加入10個菌株的樣品圖譜中，絕大多數(shù)特征吸收峰的保留時間與對照圖譜一致，但一些特征吸收峰上的物質(zhì)含量明顯降低，甚至一些吸收峰消失，如保留時間在3.987、6.76、13.193、19.607、22.813、30.273的吸收峰。這表明杜仲液接入細(xì)菌后，經(jīng)過微生物的降解作用，杜仲葉中的某些成分可能被細(xì)菌分解或利用，導(dǎo)致其成分發(fā)生了變化。

2.4 腸道細(xì)菌對幼蟲生長發(fā)育及營養(yǎng)利用的影響

2.4.1 腸道細(xì)菌對幼蟲生長發(fā)育的影響 抗生素處理對幼蟲的發(fā)育和生長均產(chǎn)生一定的影響(表2)?？股靥幚斫M，幼蟲發(fā)育歷期約為22.87天，較對照組(約21.7天)延長了1天； 抗生素組每齡幼蟲的頭寬、體長、體質(zhì)量均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)； 但后期抗生素處理組的幼蟲化蛹率(10%)顯著低于對照組的化蛹率(86.67%)，表明抗生素處理對幼蟲的正?；籍a(chǎn)生明顯影響。

2.4.2 腸道細(xì)菌對幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的影響 與對照相比，抗生素處理組幼蟲相對生長率(RGR)、食物利用率(ECI)和食物轉(zhuǎn)化率(ECD)普遍降低(表3)，尤其在1～4齡幼蟲中降低幅度較大，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而5～6齡幼蟲的降低幅度較小，沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。抗生素處理組幼蟲的消耗指數(shù)(CI)和近似消耗率(AD)均稍高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。這表明抗生素處理后，影響了正常的腸道菌群，從而導(dǎo)致幼蟲取食和消化能力降低，對營養(yǎng)的利用能力減弱，需消耗更多的食物，尤其對低齡幼蟲的影響更為顯著。

表2 抗生素處理對杜仲夢尼夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響①Tab.2 Effects of antibiotic treatment on the growth and development of O. songi larvae

表3 抗生素處理對杜仲夢尼夜蛾幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of antibiotic treatment on nutritional indices of O. songi larvae

3 討論

本研究進(jìn)行了杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌的分離鑒定，并對其功能進(jìn)行了初步的研究。利用3種培養(yǎng)基從幼蟲腸道分離獲得10株不同形態(tài)的細(xì)菌，分子鑒定表明它們隸屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的10個屬細(xì)菌，其中變形菌門為優(yōu)勢菌群。在門水平的菌群組成與其他鱗翅目昆蟲如舞毒蛾(Lymantriadispar)，棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，煙草天蛾(Manducasexta)和斜紋夜蛾(Spodopteralittoralis)的研究結(jié)果比較相似(Brodericketal., 2004； Xiangetal., 2006； Brinkmannetal., 2008； Tangetal., 2012)。但在屬的水平上，筆者從杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道獲得10株不同屬的細(xì)菌，包括短波單胞菌、腸球菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌、克呂沃爾菌屬、不動桿菌屬、莫拉菌屬、土壤桿菌屬、微桿菌屬和節(jié)桿菌屬，這與其他鱗翅目昆蟲可培養(yǎng)腸道菌的組成存在明顯差異，如家蠶(Bombyxmori)腸道可培養(yǎng)菌群主要由嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和不動桿菌屬組成(Liangetal., 2014)； 小菜蛾(Plutellaxylostella)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌主要有沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)以及類香味菌屬(Myroides)(夏曉峰等， 2013)； 棉鈴蟲腸道中分離到鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、不動桿菌和擬桿菌屬(Bacteroides)的細(xì)菌(Priyaetal., 2012)。這些差異應(yīng)該與這些鱗翅目昆蟲取食不同的寄主植物密切相關(guān)，但杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道更為豐富的菌群是否與其能消化利用含膠的杜仲葉相適應(yīng)還有待于進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

淀粉是植物中主要的能量儲備物質(zhì)，纖維素和果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分(賀學(xué)禮, 2011)。植食性昆蟲腸道內(nèi)定殖的細(xì)菌可以將這些大分子物質(zhì)分解成小分子單糖供寄主吸收和利用(Dillonetal., 2004； Anandetal., 2010)。透明圈法通常用于研究細(xì)菌對生物大分子的降解作用，Anand 等(2010)利用該方法發(fā)現(xiàn)家蠶腸道中的假單胞菌具有很強(qiáng)的降解果膠的能力，Dantur 等(2015)研究發(fā)現(xiàn)小蔗桿草螟(Diatraeasaccharalis)腸道的腸球菌對纖維素有降解作用，鄭亞強(qiáng)等(2017)從馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculella)腸道中篩選出可以降解淀粉的鞘氨醇桿菌和節(jié)桿菌。這種方法雖然可以簡單快速的篩選出降解大分子的菌株，但缺點(diǎn)是有些微生物具有降解色素的能力，它們在培養(yǎng)過程中會形成明顯的透明圈，與具有降解能力的菌株不易區(qū)分，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)(居乃琥， 2011)。DNS法的原理是利用二硝基水楊酸(DNS)在堿性條件下與還原糖發(fā)生反應(yīng)生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，然后用比色法測定還原糖含量，因其簡單準(zhǔn)確，對還原糖的種類沒有選擇性，適用于多糖(如纖維素、果膠和淀粉等)水解產(chǎn)生多種還原糖體系的檢測(白玲等， 2004)。本研究采用DNS法，結(jié)合樣品0～72 h吸光值(代表還原糖的濃度)的變化趨勢來揭示腸道菌株對3種大分子的降解能力，吸光值結(jié)果表現(xiàn)3種變化趨勢： 1)吸光值持續(xù)下降(還原糖濃度降低)，表明溶液中沒有還原糖生成，只有還原糖的消耗，菌株對大分子無降解能力； 2)吸光值持續(xù)上升，表明菌株能夠?qū)⑷芤褐械亩嗵欠纸鉃檫€原糖，導(dǎo)致還原糖濃度增加，但液體中的多糖未被降解完，表明菌株對大分子有一定的降解能力； 3)吸光值先上升后又下降，表明菌株在短時間內(nèi)分解完多糖，導(dǎo)致還原糖濃度上升，然后又開始利用消耗單糖，導(dǎo)致還原糖濃度下降，表明菌株具有較強(qiáng)的降解能力。因此，可以初步推斷菌株NT10(微桿菌)對纖維素?zé)o降解作用，菌株NA3(不動桿菌)與菌株NT7(短波單胞菌)對果膠無降解作用，其余菌株均對纖維素、果膠和淀粉均具有一定的降解能力。

此外，一些腸道菌能夠幫助宿主昆蟲防御植物的有毒次生代謝物質(zhì)，在植食性昆蟲與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化中發(fā)揮重要作用(Engeletal.， 2013)。例如，寄主植物在遭受甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼蟲取食時會釋放N-?；被?，不僅影響幼蟲的消化功能，而且可以產(chǎn)生能夠吸引天敵的揮發(fā)性物質(zhì)，而從其幼蟲前腸分離的一株微桿菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生N-?；被崴饷福瑤椭纸膺@些防御誘導(dǎo)物質(zhì)，從而影響植物防御反應(yīng)(Pingetal., 2007)。舞毒蛾幼蟲腸道內(nèi)的不動桿菌能夠降解歐洲山楊(Populustremuloides)分泌的酚苷類化合物，保護(hù)宿主不受毒害(Masonetal., 2016)。毛健夜蛾(Brithyscrini)腸道內(nèi)的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)能夠降解食物中的生物堿，大戟天蛾(Hyleseuphorbiae)腸道中的類諾卡氏菌(Nocardioides)、戈登氏菌(Gordonia)和短小桿菌(Curtobacterium)則能夠耐受植物分泌的乳膠，對昆蟲的腸道起到保護(hù)作用 (Vilanovaetal., 2016)。杜仲葉除了富含綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、蘆丁、槲皮素等多種有效成分外，還含有特征物質(zhì)杜仲膠(曾橋等， 2017)。筆者通過高效液相色譜法檢測了杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道菌對杜仲葉化學(xué)成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)的吸收峰降低、甚至消失，說明腸道菌對某些物質(zhì)產(chǎn)生影響，這種影響可能是將一些大分子物質(zhì)如多糖和蛋白分解為單糖和氨基酸供自身利用，也可能是分解了杜仲葉中的有毒成分，降低對自身的毒害作用。還需通過標(biāo)準(zhǔn)品比對，深入揭示腸道菌對杜仲葉片中特定化學(xué)成分的影響，尤其是否對杜仲膠具有降解作用。

在營養(yǎng)供應(yīng)和消化中具有關(guān)鍵作用的腸道細(xì)菌通過促進(jìn)營養(yǎng)的吸收影響宿主昆蟲的發(fā)育和健康(Paniaguaetal., 2018)。筆者通過喂食抗生素消除杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道菌群，研究結(jié)果顯示處理組幼蟲的相對生長率、食物轉(zhuǎn)化率與利用率均低于對照組，而消耗指數(shù)與近似消耗率則高于對照組。這可能是由于缺乏腸道細(xì)菌共生體，寄主昆蟲無法將攝取的食物順利轉(zhuǎn)化為它們所需的營養(yǎng)，導(dǎo)致食物轉(zhuǎn)化率和利用率降低，必須靠攝入更多的食物來維持機(jī)體需要，因而導(dǎo)致消耗指數(shù)與近似消耗率升高。相似的規(guī)律也在地中海粉螟(Ephestiakuehniella)和小菜蛾腸道細(xì)菌的功能研究中發(fā)現(xiàn)(Goharrostamietal.， 2018； 沈金紅等， 2018)。但一些研究認(rèn)為利用抗生素處理昆蟲來評價(jià)腸道微生物必須充分考慮抗生素對宿主昆蟲的直接效應(yīng)(劉凌云等， 2015)，所以下一步需要將這些腸道菌喂食給抗生素處理后的幼蟲，觀察是否能促進(jìn)幼蟲生長發(fā)育和對食物的轉(zhuǎn)化和利用率，驗(yàn)證腸道菌的功能。

本研究僅利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法進(jìn)行了腸道細(xì)菌的分離，并對獲得的菌株進(jìn)行功能的初步研究。但由于分離培養(yǎng)的方法僅能分離出約1%的腸道細(xì)菌(葉姜瑜等， 2004)，后續(xù)仍需借助高通量測序、宏基因組或微生物組等方法全面揭示其腸道細(xì)菌的組成、變化規(guī)律，深入揭示腸道微生物在該種昆蟲與杜仲協(xié)同進(jìn)化中的代謝機(jī)制。同時，繼續(xù)開展腸道菌的功能研究，揭示其對杜仲葉成分、杜仲膠結(jié)構(gòu)的影響； 對功能明顯的菌株進(jìn)行種的鑒定和理化性質(zhì)分析； 也可通過人為的調(diào)控或改良杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌組成，或改變某種細(xì)菌在腸道內(nèi)的數(shù)量或者密度打破其腸道微生態(tài)平衡，尋找控制其種群密度和防治害蟲的新方法。

4 結(jié)論

杜仲夢尼夜蛾幼蟲腸道中可分離培養(yǎng)的10株細(xì)菌分別隸屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的10個屬，包括短波單胞菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、克呂沃爾菌屬、不動桿菌屬、莫拉菌屬、土壤桿菌屬、微桿菌屬和節(jié)桿菌屬。大部分菌株對生物大分子(纖維素、果膠和淀粉)均有不同程度的降解作用，并顯著影響杜仲葉中成分的變化。飼喂抗生素消除腸道菌群可影響幼蟲的生長發(fā)育，顯著降低幼蟲的化蛹率和低齡幼蟲的取食和消化能力。因此，腸道細(xì)菌在杜仲夢尼夜蛾幼蟲的生長發(fā)育、食物消化、營養(yǎng)物質(zhì)利用等方面發(fā)揮著重要作用。