萬芬，蔣雷，王軍，陶麗媛，唐金榮

甲基苯丙胺(METH)俗稱冰毒，是高度成癮的精神興奮類藥物。全球吸食冰毒的人口數(shù)量達(dá)到了五千兩百萬，僅次于排名第一的大麻[1]，給社會(huì)帶來了嚴(yán)重的治安問題。我院急診收治的METH成癮者多以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主就診，大量吸食會(huì)造成精神錯(cuò)亂、幻覺、性沖動(dòng)、休克，長(zhǎng)期吸食會(huì)造成體質(zhì)量減輕、抑郁、認(rèn)知功能障礙等。長(zhǎng)期暴露于METH會(huì)導(dǎo)致腦血管病以及相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其原因和CNS炎癥有密切關(guān)系。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的固有免疫細(xì)胞。生理狀態(tài)下，大部分小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，參與維持CNS微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、誘導(dǎo)突觸形成、神經(jīng)元的發(fā)生。病理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，通過直接吞噬受損的神經(jīng)元并分泌一系列的細(xì)胞因子及炎癥因子，發(fā)揮保護(hù)作用。然而小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活會(huì)進(jìn)一步加重外界因素引起的神經(jīng)元損傷以及參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，如Alzheimer’s病[2-3]、帕金森病[4-5]。Toll樣受體4(TLR4)高度表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞表面。很多研究表明，TLR4受體激活后，引起核因子κB(NF-κB)活化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致促炎介質(zhì)的分泌及釋放，參與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。銀杏內(nèi)酯B(GB)是銀杏提取物中的萜類內(nèi)酯之一。有研究證實(shí)，GB在大鼠的腦缺血再灌注模型中能夠抑制NF-κB激活，發(fā)揮抗炎作用[7-8]。本研究通過METH誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的活化，探討GB對(duì)BV2細(xì)胞激活后的TLR4-NF-κB炎性信號(hào)通路的影響及對(duì)METH引發(fā)的炎癥反應(yīng)的治療作用，為臨床應(yīng)用GB治療METH引起的神經(jīng)退行性變提供更深入的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 GB購于Sigma-Aldrich公司；METH購于國家食品藥品管制研究所；BV2細(xì)胞購于美國菌種儲(chǔ)存中心；TLR4siRNA購于Gene Pharma公司；anti-TLR4購于Abcam公司；anti-CD11b購于Bio-Rad公司；anti-p-NF-κB、anti-NF-κB購于Cell Sig-naling Technology公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購于R&D Systems公司；BCA試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司；CKX31顯微鏡，日本OLYMPUS；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo；高速離心機(jī)，美國Beckman；恒溫水浴鍋，中國江蘇宏凱；酶標(biāo)儀，美國TECAN；垂直電泳儀，美國Bio-Rad；曝光儀，美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 BV2細(xì)胞培養(yǎng)、傳代方法 BV2細(xì)胞用添加了10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的溫箱中孵育。細(xì)胞用PBS、胰酶處理后，離心打入新鮮培養(yǎng)基，吹打均勻，放入溫箱孵育24 h。

1.2.2 BV2細(xì)胞分組、給藥方法 根據(jù)不同處理方法將BV2細(xì)胞分為對(duì)照組、GB組、METH組、GB+METH組、NC組、METH+NC組、TLR4siRNA組及TLR4siRNA+METH組。具體給藥方法如下：(1)對(duì)照組：等數(shù)量的BV2細(xì)胞采用培養(yǎng)基孵育24 h。(2)GB組：根據(jù)GB濃度不同分為30、60、120、240、480、960 μmol/L GB組，采用相應(yīng)濃度的GB孵育BV2細(xì)胞24 h。(3)METH組：根據(jù)METH濃度不同分為0、300、600、1 000 μmol/L METH組，采用相應(yīng)濃度METH刺激BV2細(xì)胞24 h，收集上清、提取細(xì)胞蛋白，由METH濃度對(duì)BV2細(xì)胞活力、TLR4、p-NF-κB以TNF-α、IL-1β、IL-6的影響，選擇METH的最佳濃度；根據(jù)METH處理時(shí)間不同分為0、12、24、48 h METH組，采用1 000 μmol/L METH(最佳濃度)分別刺激BV2細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，收集上清、提取細(xì)胞蛋白，由METH作用時(shí)間對(duì)BV2活化、TLR4、p-NF-κB以及TNF-α、IL-1β、IL-6的影響，選擇METH的最佳刺激時(shí)間。(4)30、60、120、240、480、960 μmol/L GB+METH組：采用上述濃度GB預(yù)孵BV2細(xì)胞2 h后，PBS洗2次，1 000 μmol/L METH刺激BV2細(xì)胞24 h。(5)NC組：采用空載體與BV2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，換新鮮培養(yǎng)基孵育，再培養(yǎng)24 h。(6)METH+NC組：采用空載體與BV2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，再用1 000 μmol/L METH培養(yǎng)BV2細(xì)胞24 h。(7)TLR4siRNA組：采用TLR4siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育6 h之后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。(8)TLR4siRNA+METH組：采用TLR4siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育6 h后，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，PBS洗2次，用1 000 μmol/L METH刺激BV2細(xì)胞24 h。

1.2.3 細(xì)胞活力的檢測(cè) 將BV2細(xì)胞以3×104～5×104個(gè)/ml密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，取對(duì)照組，30、60、120、240、480、960 μmol/L GB組，1 000 μmol/L METH組，30、60、120、240、480、960 μmol/L GB+1 000 μmol/L METH組BV2細(xì)胞，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8試劑，酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度(OD)。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(加藥組OD值-本底組OD值)/(對(duì)照組OD值-本底組OD值)×100%。

1.2.4 CD11b、TLR4、磷酸化的核因子κB(p-NF-κB)表達(dá)的檢測(cè) 采用Western Blotting法檢測(cè)METH濃度組、METH時(shí)間組、120 μmol/L GB組、120 μmol/L GB+METH組的CD11b的變化，研究GB對(duì)METH引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用；檢測(cè)METH濃度組、METH時(shí)間組的TLR4、p-NF-κB的表達(dá)水平，研究METH對(duì)TLR4、p-NF-κB表達(dá)的影響；檢測(cè)120 μmol/L GB組、120 μmol/L GB+METH組、NC組、METH+NC組、TLR4siRNA組、TLR4siRNA+METH組的TLR4、p-NF-κB的表達(dá)水平，研究GB對(duì)TLR4-NF-κB通路活化后的影響。收集細(xì)胞上清培養(yǎng)基置于-70 ℃儲(chǔ)存。提取細(xì)胞蛋白，冰PBS洗滌細(xì)胞后，加裂解液置于冰上裂解，刮下細(xì)胞，4 ℃離心15 min，收集上清液。取BCA標(biāo)準(zhǔn)品及蛋白至相應(yīng)微孔板，滴加BCA反應(yīng)液，37 ℃溫箱孵育30 min，測(cè)量562 nm的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白的濃度。將20 μg蛋白依次序加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。剪出目的條帶，加入一抗，4 ℃，過夜。TBST漂洗目的條帶，加入二抗，室溫下孵育2 h，再TBST漂洗。條帶瀝干，加入ECL工作液，曝光。用ImageJ-64圖像軟件對(duì)蛋白條帶定量分析，蛋白質(zhì)的相對(duì)含量用目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示。

1.2.5 TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)NC組、METH+NC組、TLR4siRNA組、TLR4siRNA+METH組的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，研究TLR4-NF-κB通路對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6的影響；檢測(cè)METH濃度組、METH時(shí)間組及120 μmol/L GB組、120 μmol/L GB+METH組的TNF-α、IL-1β和IL-6的變化，研究GB對(duì)METH引發(fā)的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，設(shè)置空白對(duì)照孔和反應(yīng)孔，分別依次序加入標(biāo)準(zhǔn)品，洗板后，空白對(duì)照孔、反應(yīng)孔分別對(duì)應(yīng)加入生物素化抗體稀釋液、生物素化抗體工作液。再次洗板，空白對(duì)照孔、反應(yīng)孔分別對(duì)應(yīng)加入酶結(jié)合物稀釋液、酶結(jié)合物工作液。洗板，加入顯色底物，溫箱孵育后加入反應(yīng)終止液，混勻，酶標(biāo)儀測(cè)量OD450數(shù)值。

2 結(jié) 果

2.1 GB對(duì)METH誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞毒性的影響 對(duì)照組細(xì)胞活力為(100.00±3.69)%，30、60、120、240、480、960 μmol/L GB組細(xì)胞活力分別為(110.36±6.78)%、(101.76±8.21)%、(101.78±9.58)%、(103.52±7.65)%、(98.51±5.85)%、(99.21±6.81)%，1 000 μmol/L METH組細(xì)胞活力為(82.37±5.65)%，30、60、120、240、480、960 μmol/L GB+METH組細(xì)胞活力分別為(82.37±5.65)%、(89.87±6.23)%、(91.87±2.64)%、(101.23±3.43)%、(97.84±2.92)%、(92.56±9.26)%、(90.47±4.18)%。與對(duì)照組比較，30、60、120、240、480、960 μmol/L GB組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，1 000 μmol/L METH組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。與1 000 μmol/L METH組比較，120 μmol/L GB+METH組及240 μmol/L GB+METH組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05～0.01)。

2.2 GB對(duì)METH引起的BV2細(xì)胞活化的影響 見圖1。與0 μmol/L METH組(0.49±0.05)相比，300 μmol/L METH組(0.71±0.07)CD11b表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，600 μmol/L METH組(0.93±0.13)及1 000 μmol/L METH組(1.21±0.23)CD11b表達(dá)顯著增加(均P<0.05)，且呈濃度依賴性。與0 h METH組(0.54±0.02)相比，12 h METH組(0.77±0.04)、24 h METH組(0.95±0.07)及48 h METH組(0.99±0.03)CD11b的表達(dá)顯著增加(P<0.05～0.001)。與對(duì)照組(0.48±0.02)比較，1 000 μmol/L METH組(1.28±0.14)CD11b表達(dá)顯著升高(P<0.05)，120 μmol/L GB組(0.58±0.01)及120 μmol/L GB+METH組(0.85±0.06)CD11b表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與1 000 μmol/L METH組相比，120 μmol/L GB+METH組CD11b表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.3 METH對(duì)BV2細(xì)胞TLR4-NF-κB 通路的影響 見表1、表2和圖2。與0 μmol/L METH組相比，300 μmol/L METH組、600 μmol/L METH組及1 000 μmol/L METH組TLR4表達(dá)及1 000 μmol/L METH組p-NF-κB表達(dá)顯著升高(P<0.05～0.01)。與0 h METH組比較，12 h METH組、24 h METH組及48 h METH組TLR4及p-NF-κB均表達(dá)顯著升高(P<0.05～0.01)。

圖1 GB對(duì)METH引起的BV2細(xì)胞活化的影響

表2 不同METH處理時(shí)間組TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的比較(x±s)組別TLR4p-NF-κBTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)0 h METH組0.56±0.060.51±0.04172.41±19.0467.14±7.8567.14±7.8512 h METH組0.81±0.06*1.08±0.07*342.52±25.64***128.57±20.83**128.57±20.83**24 h METH組0.96±0.05**0.99±0.06*916.67±32.49***297.74±18.32**297.74±18.32**48 h METH組1.39±0.08**0.96±0.06*1149.98±62.31***385.71±30.61**385.71±30.61** 注:與0 h METH組比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

圖2 METH濃度和刺激時(shí)間對(duì)BV2細(xì)胞TLR4、p-NF-κB表達(dá)的影響

2.4 TLR4-NF-κB通路對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6的影響 見表3、圖3。與NC組比較，METH+NC組TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05～0.01)。與METH+NC組比較，TLR4siRNA組TLR4、p-NF-κB的表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.01)，TLR4siRNA+METH組TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05～0.01)。

表3 NC組、METH+NC組、TLR4siRNA組、TLR4siRNA+METH組TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的比較(x±s)組別TLR4p-NF-κBTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)METH+NC組1.18±0.09*1.05±0.12*1142.84±70.53**362.51±21.68**778.76±41.23**TLR4siRNA組0.54±0.08▲0.45±0.20▲165.86±13.5681.29±9.74134.52±10.49TLR4siRNA+METH組0.71±0.05△0.84±0.25357.19±34.68▲121.78±16.28▲294.32±39.67▲NC組0.86±0.070.71±0.18171.43±12.1461.85±8.21128.89±9.38 注:與NC組比較*P<0.05,**P<0.01;與METH+NC組比較△P<0.05,▲P<0.01

圖3 干擾TLR4對(duì)TLR4、p-NF-κB表達(dá)的影響

2.5 GB對(duì)METH引發(fā)的TLR4-NF-κB通路活化的影響 見表4、圖4。與對(duì)照組比較，1 000 μmol/L METH組BV2細(xì)胞TLR4、p-NF-κB表達(dá)顯著增加(均P<0.05)。與1 000 μmol/L METH組相比，120 μmol/L GB+METH組BV2細(xì)胞TLR4、p-NF-κB表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。

表4 對(duì)照組、120 μmol/L GB組、1000 μmol/L METH組、120 μmol/L GB+METH組TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的比較(x±s)組別TLR4p-NF-κBTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)120 μmol/L GB組0.69±0.190.77±0.10154.23±9.7163.82±10.84109.76±11.591000 μmol/L METH組1.03±0.11*1.25±0.10*1124.62±61.76**421.57±20.49**780.29±21.65**120 μmol/L GB+METH組0.63±0.11△0.82±0.09△672.12±47.46▲259.97±23.68▲52.85±26.71▲對(duì)照組0.51±0.120.70±0.09159.54±8.7669.57±9.57112.47±10.35 注:與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.001;與1000 μmol/L METH組比較△P<0.05,▲P<0.01

圖4 GB干預(yù)組的TLR4、p-NF-κB表達(dá)

2.6 GB對(duì)METH引發(fā)的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響 見表1、表2、表4。與0 μmol/L METH組相比，300、600、1 000 μmol/L METH組TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(均P<0.01)，并且呈濃度依賴性。與0 h METH組比較，12 h、24 h、48 h METH組TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(均P<0.01)，并且呈時(shí)間依賴性。與對(duì)照組比較，1 000 μmol/L METH組TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(均P<0.01)。與1 000 μmol/L METH組比較，120 μmol/L GB+METH組TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低(均P<0.01)。

3 討 論

本研究證實(shí)，TLR4參與了METH引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，且與炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平呈正相關(guān)。同時(shí)本研究也證實(shí)了GB能夠抑制METH引起的BV2細(xì)胞的TLR4、p-NF-κB及TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)。提示TLR4參與了METH引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，GB通過下調(diào)TLR4-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)METH引發(fā)炎癥的保護(hù)作用。

長(zhǎng)時(shí)間吸食METH會(huì)引起腦動(dòng)脈硬化[9]、認(rèn)知能力損害，導(dǎo)致腦血管病[9-10]、Alzheimer’s病的發(fā)生發(fā)展，而中樞炎癥是該過程進(jìn)展的重要因素[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，METH吸食者的腦內(nèi)不同區(qū)域均有小膠質(zhì)細(xì)胞激活[14]，另外METH能夠增加小鼠腦中TNF-α、IL-6的表達(dá)[15]。本研究證實(shí)了METH濃度、時(shí)間依賴性地增加了BV2細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。這和先前研究認(rèn)為METH在HAPI小膠質(zhì)細(xì)胞中能夠增加TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)是一致的[16]。然而，有研究也發(fā)現(xiàn)，METH刺激THP-1細(xì)胞，不會(huì)對(duì)其表達(dá)的IL-1β水平產(chǎn)生影響[17]。這些結(jié)果的不一致或許是因?yàn)槭褂玫募?xì)胞系及藥物劑量的不同。

TLR4受體為先天性固有的免疫受體，廣泛地表達(dá)于全身各器官、組織。在CNS，TLR4主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞表面[18-20]，而小膠質(zhì)細(xì)胞激活后參與了中樞炎癥的發(fā)生及發(fā)展。TLR4受體在固有免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵性的作用，因此TLR4相關(guān)的中樞炎癥近來也獲得了越來越多的關(guān)注。研究認(rèn)為，TLR4受體參與了Alzheimer’s病中Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及神經(jīng)毒性[21-22]。此外，TLR4被認(rèn)為通過NF-κB信號(hào)通路參與了腦缺血-再灌注損傷中的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及中樞神經(jīng)炎癥[23-24]。然而，TLR4-NF-κB信號(hào)通路是否參與METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥并不清楚。本研究證實(shí)，METH刺激BV2細(xì)胞后，TLR4和p-NF-κB的表達(dá)水平顯著增加，且參與了TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。此外，TLR4 siRNA沉默掉TLR4基因表達(dá)，能夠明顯抑制METH誘導(dǎo)的炎癥因子生成，這也進(jìn)一步證實(shí)了TLR4在METH誘導(dǎo)的中樞炎癥中起關(guān)鍵作用。然而，TLR4的敲減不能明顯減少M(fèi)ETH誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)，這意味著TLR信號(hào)通路可能參與METH誘導(dǎo)的炎癥，如TLR9受體[25]。

研究表明，GB通過抑制NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，減輕腦出血損傷[26]。然而，GB是否對(duì)METH介導(dǎo)的中樞炎癥有保護(hù)作用目前仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，GB預(yù)處理能夠顯著抑制METH誘導(dǎo)的炎癥蛋白TLR4、p-NF-κB，從而抑制炎癥因子TNF-a、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，減輕METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。這和先前的研究結(jié)果，即GB在腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷模型中通過TLR4通路發(fā)揮抗炎作用是一致的[26-27]。此外，GB對(duì)于METH的靶點(diǎn)——多巴胺能、5-羥色胺系統(tǒng)具有保護(hù)作用[28-30]。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GB對(duì)于METH誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的具有保護(hù)作用。

TLR4介導(dǎo)了METH引發(fā)的中樞炎癥反應(yīng)，GB能夠通過抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路，減輕METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及下游炎癥因子的分泌。因此，GB可以抑制METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及中樞炎癥，為指導(dǎo)臨床應(yīng)用本研究小組將進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。