杜煜,馬宇,盧柳西,黃巧,展群嶺,李興貴

帕金森病(PD)是CNS的變性疾病，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變和路易小體形成，患者主要表現(xiàn)為震顫、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)平衡障礙、運(yùn)動(dòng)遲緩，病情嚴(yán)重者生活難以自理，給患者家庭以及社會(huì)都帶來(lái)了沉重的疾病負(fù)擔(dān)[1]。PD起病隱襲，在疾病早期臨床癥狀較輕或癥狀不典型，一般PD患者要在多巴胺能神經(jīng)元減少50%和(或)紋狀體內(nèi)多巴胺水平減少70%～80%時(shí)才會(huì)出現(xiàn)典型的運(yùn)動(dòng)癥狀，這導(dǎo)致PD在早期容易被誤診或漏診[2]，因此尋找與PD相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的小分子單鏈RNA，通過(guò)與靶基因mRNA3′非編碼區(qū)的堿基配對(duì)調(diào)節(jié)靶mRNA的降解或翻譯抑制，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控[3]。微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是一種關(guān)于神經(jīng)疾病密切相關(guān)的miRNA，其在黑質(zhì)、紋狀體、伏隔核、新皮質(zhì)和海馬等多個(gè)腦部區(qū)域中均有表達(dá)[4]。且有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[5]證實(shí)，miR-7可調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白(α-synuclein)的表達(dá)，進(jìn)而在PD的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用。然而目前關(guān)于miR-7與PD相關(guān)的臨床研究較少，其與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系及其對(duì)疾病的診斷價(jià)值尚不清楚。本研究旨在探討miR-7在PD患者血清中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)作如下報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月到2019年10月期間在我院接受治療的PD患者58例作為PD組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均根據(jù)《中國(guó)帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016版)》中的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行診斷[6]；(2)病歷資料完整；(3)患者及其家屬對(duì)本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦卒中、腦外傷、腦膜炎等病史；(2)合并有神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(3)患有嚴(yán)重癡呆伴記憶力、語(yǔ)言和行為障礙；(4)合并有惡性腫瘤者；(5)合并有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者。另選取同期在我院體檢的30名健康志愿者作為對(duì)照組。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-7檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-7的相對(duì)表達(dá)量。采用真空采血管收集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血6 ml，3 000 r/min離心10 min，提取上清液。取適量血清加入Trizol溶解試劑，充分混勻裂解，提取總RNA后通過(guò)分析260 nm和280 nm的紫外吸收值的比值(A260/A280)確認(rèn)RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，以U6為內(nèi)參檢測(cè)血清miR-7的相對(duì)表達(dá)量。miR-7正向引物：5′-AAA GAA CAT CCA GGC AAA TGT GA-3′，miR-7反向引物：5′-CCG CCT AAC GTA CGC GCA TAT T-3′，U6正向引物：5′-CTG CGA AGC CGT GCT CA-3′，U6反向引物：5′-AGC GTT GAG CAA TTA GCG T-3′，95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2- Ct法計(jì)算血清中miR-7的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表(UPDRS)評(píng)定 由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)務(wù)人員，在PD患者處于安靜狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行UPDRS評(píng)分。UPDRS共分為6部分，本研究主要選用其中的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分[7]。 第Ⅰ部分為精神、行為及情緒，用于判斷PD患者的精神活動(dòng)和情感障礙；第Ⅱ部分為日常生活活動(dòng)，用于判斷PD患者的日常生活能力；第Ⅲ部分為運(yùn)動(dòng)檢查，用于判斷PD患者的運(yùn)動(dòng)功能。各項(xiàng)目均分為5個(gè)等級(jí)，計(jì)分為0～4分，其中0分表示正常，分?jǐn)?shù)越高表示癥狀越重。同時(shí)采用Hoehn-Yahr分級(jí)進(jìn)行分組，其中<Ⅲ期的患者納入到輕度PD組(25例)，≥Ⅲ期的患者納入到重度PD組(33例)[7]。

2 結(jié) 果

2.1 PD患者和對(duì)照組的一般資料比較 兩組研究對(duì)象的男女比例、年齡、高血壓、糖尿病比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。PD患者的的病程、UPDRS Ⅰ評(píng)分、UPDRS Ⅱ評(píng)分、UPDRS Ⅲ評(píng)分的具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 PD患者和對(duì)照組的一般資料比較(例,%,x±s)組別男/女年齡(歲)高血壓糖尿病病程(年)UPDRS Ⅰ評(píng)分(分)UPDRS Ⅱ評(píng)分(分)UPDRS Ⅲ評(píng)分(分)PD組(n=58)32/2657.36±8.3214(24.14)10(17.24)4.52±3.183.63±2.4219.56±8.2935.89±10.35對(duì)照組(n=30)18/1255.23±7.265(16.67)3(10.00)----χ2/t值0.1881.1870.6520.349----P值0.6650.2380.4190.555----

2.2 不同研究對(duì)象血清miR-7相對(duì)表達(dá)量的比較 PD組的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量為(0.77±0.28)，明顯低于對(duì)照組的(1.04±0.36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.882，P=0.000)。輕度PD組的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量為(0.88±0.31)，明顯高于重度PD組的(0.69±0.22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.731，P=0.008)。

2.3 PD患者血清miR-7與病程、UPDRS評(píng)分、Hoehn-Yahr分級(jí)的相關(guān)性分析 見表2。Pearson分析顯示， PD患者血清miR-7與病程、UPDRS Ⅰ評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)，但與UPDRS Ⅱ評(píng)分、UPDRS Ⅲ評(píng)分、Hoehn-Yahr分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

表2 PD患者血清miR-7與病程、UPDRS評(píng)分、Hoehn-Yahr分級(jí)的相關(guān)性分析指標(biāo)miR-7r值P值病程-0.2020.098UPDRS Ⅰ評(píng)分-0.2560.074UPDRS Ⅱ評(píng)分-0.3140.023UPDRS Ⅲ評(píng)分-0.3650.000Hoehn-Yahr分級(jí)-0.2980.046

2.4 血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值分析 以PD患者的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)作為陽(yáng)性數(shù)據(jù)，以對(duì)照組的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)作為陰性數(shù)據(jù)，建立ROC曲線分析血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值一般，曲線下面積為0.698(95%CI：0.573～0.822)，其最佳診斷閾值為0.95，敏感度為53.45%，特異性為86.67%。ROC曲線如圖1所示。

圖1 血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值的ROC曲線圖

3 討 論

PD是僅次于Alzheimer’s病的第二大神經(jīng)退行性疾病。據(jù)世界帕金森病協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[8]顯示，全球約有570萬(wàn)例PD患者。而我國(guó)是PD高發(fā)的國(guó)家，患病人數(shù)約270萬(wàn)，且PD的主要發(fā)病群體為老年人?？梢灶A(yù)見，隨著近年來(lái)我國(guó)老年化社會(huì)的到來(lái)，PD患者的數(shù)量將進(jìn)一步上升[9]。目前臨床多采用多巴胺替代療法、多巴胺受體激動(dòng)劑、抗膽堿能制劑等治療PD，但以上治療方法僅能緩解患者的臨床癥狀，難以阻止疾病的進(jìn)展。就目前的醫(yī)學(xué)手段而言，患者越早診斷、越早干預(yù)，病情才越可能得到有效的控制和緩解[10]。然而PD患者的早期臨床表現(xiàn)不易察覺，且目前尚缺乏準(zhǔn)確的早期客觀診斷指標(biāo)，因此迫切需要探究與PD密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，用于臨床輔助診斷PD。miRNA是一類真核生物內(nèi)源性的小分子單鏈RNA，長(zhǎng)度為18～25 nt。目前已有相關(guān)研究[11]證明，miRNA與PD等多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如miRNA-4639可靶向調(diào)節(jié)PD相關(guān)蛋白DJ-1的表達(dá)，進(jìn)而在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[12]。miRNA除了具有豐富的生物學(xué)功能之外，還可在血清、唾液、尿液等體液中都能保持穩(wěn)定狀態(tài)，具有便于檢測(cè)、可重復(fù)性高等特點(diǎn)，因此尋找與PD相關(guān)的miRNA成為臨床研究的熱點(diǎn)。

miR-7是一種在機(jī)體腦組織中高表達(dá)的miRNA，其成熟體和前體序列具有較高的保守性。過(guò)往研究多集中在miR-7與惡性腫瘤相關(guān)的方向[13]。但近年來(lái)的研究[14]顯示，miR-7是一種與PD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miRNA。本研究結(jié)果顯示，PD組的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且輕度PD組的血清miR-7相對(duì)表達(dá)量高于重度PD組，這提示血清miR-7在PD患者中呈異常低表達(dá)，且其表達(dá)水平可能與患者的病情嚴(yán)重程度存在一定的關(guān)系。通過(guò)進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PD患者血清miR-7與UPDRS Ⅱ評(píng)分、UPDRS Ⅲ評(píng)分、Hoehn-Yahr分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)，這再次提示了miR-7的表達(dá)水平與患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。α-synuclein在PD發(fā)病機(jī)理中具有重要作用，其過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和特定的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡，促進(jìn)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致PD的發(fā)生[15]。相關(guān)研究顯示，miR-7可直接負(fù)性調(diào)控α-synuclein的表達(dá)，并可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)清除α-synuclein及其聚集物，進(jìn)而影響PD的疾病進(jìn)展[16]。還有研究證實(shí)，miR-7可通過(guò)抑制Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活，減輕神經(jīng)炎癥，進(jìn)而起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用[17]。Mcmillan等[18]的研究還發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-7的表達(dá)后，會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的丟失，同時(shí)減少紋狀體內(nèi)多巴胺含量。這就證實(shí)miR-7的表達(dá)水平與多巴胺能神經(jīng)元的狀態(tài)有關(guān)，而miRNA均可在血液中穩(wěn)定表達(dá)，血清中的表達(dá)水平與組織內(nèi)的表達(dá)水平有較好的一致性，因此血清中miR-7的變化也可在一定程度上影響中樞神經(jīng)多巴胺能神經(jīng)元。由此可見，miR-7可通過(guò)多個(gè)途徑參與PD的發(fā)生、發(fā)展，是PD發(fā)病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有作為PD新的生物標(biāo)志物的潛力。本研究通過(guò)ROC曲線分析了血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-7診斷PD的曲線下面積為0.698(95%CI：0.573～0.822)，其敏感度和特異性分別為53.45%、86.67%。這提示血清miR-7對(duì)PD的診斷價(jià)值一般，曲線下面積還略低于0.7。值得注意的是，miR-7診斷PD的特異性較高，這說(shuō)明其陰性診斷能力較強(qiáng)。目前尚未發(fā)現(xiàn)單一的生物標(biāo)志物可較好的診斷PD，今后的研究趨勢(shì)是聯(lián)合應(yīng)用多種的生物學(xué)標(biāo)志物，制定出預(yù)測(cè)PD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)模型，以便在疾病早期甚至是在PD前驅(qū)期就實(shí)行合理有效的干預(yù)措施，進(jìn)而更好的改善患者的生活質(zhì)量[19]。

綜上所述，miR-7在PD患者血清中呈異常低表達(dá)，且其表達(dá)水平可在一定程度上反映病情嚴(yán)重程度，但對(duì)PD的診斷價(jià)值一般。本研究選取的病例數(shù)較少，且為單中心研究，同時(shí)未分析治療前后miR-7的動(dòng)態(tài)變化，在后續(xù)的研究中將增加病例數(shù)，同時(shí)分析miR-7對(duì)臨床治療效果是否具有評(píng)估價(jià)值。目前miR-7在PD中的作用機(jī)制尚未完全闡明，還處于初級(jí)研究階段，期待更多更深入的研究。