解鴻翔，曹文靜，謝姝惠，郭建壯，李曉鳳，呂士玉，馬建萍，劉翠萍(1.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，杭州10014；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，b.保健綜合科，濟(jì)南 250014；.臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江臺(tái)州 18000)

霍亂弧菌(Vibriocholerae)是一種致病性的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于地表的各類水域生態(tài)系統(tǒng)。根據(jù)菌體表面O抗原可將霍亂弧菌分為200多個(gè)血清群，其中只有O1和O139群可以引起霍亂的暴發(fā)或流行[1]。非O1/O139群霍亂弧菌(non-O1/non-O139Vibriocholerae，NOVC)是除O1群和O139群以外血清群的總稱，常引起輕到中度的胃腸炎、菌血癥、中耳炎和傷口感染等[2]。雖然在形態(tài)和生化反應(yīng)上與O1群和O139群霍亂弧菌沒有區(qū)別，但NOVC菌株一般缺乏產(chǎn)毒性霍亂弧菌的幾個(gè)主要的毒力因子，如霍亂毒素(cholera toxin，CTX)和毒素共調(diào)節(jié)菌毛(toxin coregulated pilus，TCP)，其致病性與其他毒力因子有關(guān)，包括溶血素(hemolytic cytolytic A，hlyA)、血凝素蛋白酶(hemagglutinin protease，hap)、熱穩(wěn)定腸毒素(heat stable enterotoxin，ST)、RTX毒素(repeat-like toxin，rtx)、6型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system，T6SS)等[3]。近年來，NOVC引起腸道外侵襲性感染的報(bào)道逐漸增多[3-4]，但口腔感染NOVC的病例仍然非常罕見。本研究鑒定了1株導(dǎo)致食管癌術(shù)后放化療患者口腔感染的NOVC，并對(duì)其病原生物學(xué)特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1病歷資料及菌株來源 患者男，51歲，因“發(fā)現(xiàn)血小板減少10余天”于2019年10月8日就診山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。患者述平日喜食魚蝦，10余天前因進(jìn)食海蝦后出現(xiàn)發(fā)熱(體溫高達(dá)38.5 ℃)、腹痛、腹瀉而就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院。當(dāng)時(shí)腹瀉1 d,10余次,水樣便，并很快于口唇及臉頰內(nèi)側(cè)出現(xiàn)多發(fā)血泡，易破潰，上下唇內(nèi)側(cè)黏膜和上腭黏膜廣泛糜爛，融合成片狀并上覆偽膜，舌底出現(xiàn)較大潰瘍面，疼痛明顯，影響進(jìn)食。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院給予抗感染、止瀉、升白細(xì)胞及升血小板等治療，患者體溫正常，腹瀉好轉(zhuǎn)，但血小板始終未有升高，為求進(jìn)一步診療入住我院。既往“食道癌術(shù)后”，已行化療12次，放療27次?；颊呷朐簳r(shí)體溫36.8 ℃，生命體征平穩(wěn)；口唇可見血泡，口腔內(nèi)可見片狀白斑，舌底可見潰瘍；雙肺叩診呈清音，聽診雙肺呼吸音粗；上腹部可見一條10 cm左右縱形疤痕，雙下肢輕度水腫，余查體未見明顯異常?；颊呷朐汉蟪霈F(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，胸部CT提示雙肺炎癥，實(shí)驗(yàn)室檢查：WBC 3.34×109/L，Neu 2.71×109/L，RBC 2.03×1012/L，Hb 75.0 g/L，PLT 13×109/L，清蛋白34.80 g/L，C反應(yīng)蛋白25 mg/L，降鈣素原0.156 ng/mL，曲霉菌抗原檢測(cè)、真菌G試驗(yàn)、血培養(yǎng)均陰性，大便常規(guī)、大便培養(yǎng)、尿常規(guī)、肝功能生化指標(biāo)、腎功能生化指標(biāo)、電解質(zhì)等未見明顯異常。留取患者口腔拭子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果回報(bào)NOVC生長。給予頭孢哌酮/舒巴坦控制感染及預(yù)防出血、糾正貧血、刺激骨髓造血等對(duì)癥支持治療，患者體溫降至正常，口腔感染癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

1.2主要儀器與試劑 全自動(dòng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析儀及配套試劑(德國布魯克公司)，Qubit 2.0熒光計(jì)(美國賽默飛世爾公司)，NovaSeq PE150測(cè)序儀(美國Illumina公司)；血瓊脂平板和弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS，濟(jì)南百博公司)，O1、O139群霍亂弧菌診斷血清(寧波天潤公司)，藥敏紙片(英國Oxoid公司)，SDS(國藥試劑有限公司)，Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(美國NEB公司)。

1.3細(xì)菌分離培養(yǎng) 取患者上下唇內(nèi)側(cè)黏膜和上腭黏膜糜爛處分泌物接種于血瓊脂平板中，置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后取菌落涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.4MALDI-TOF MS鑒定 用接種環(huán)取少量血瓊脂平板上生長的單個(gè)菌落均勻涂布于MALDI靶板，自然干燥；加入1 μL基質(zhì)液，待自然干燥后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)待測(cè)菌圖譜與數(shù)據(jù)庫中特征主峰譜的對(duì)比情況進(jìn)行鑒定，并用分?jǐn)?shù)表示：分值2.300～3.000表示完全可靠的鑒定到種水平，2.000～2.299表示鑒定到種水平，1.700～1.999表示鑒定到屬水平，0.000～1.699表示沒有可靠的鑒定結(jié)果。

1.5血清群鑒定 血平板上取適量單個(gè)菌落，分別與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清充分涂勻，進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，以生理鹽水作陰性對(duì)照。

1.6藥物敏感試驗(yàn) 根據(jù)2016年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)發(fā)布的M45文件中對(duì)霍亂弧菌的藥敏試驗(yàn)要求進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)。

1.7基因組分析 用SDS法提取樣本基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，用Qubit熒光計(jì)進(jìn)行定量[5]。檢測(cè)合格的DNA樣品進(jìn)行文庫制備、Illumina NovaSeq PE150測(cè)序。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質(zhì)量數(shù)據(jù)。將得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)使用SOAP denovo[6]、SPAdes[7]、ABySS[8]組裝軟件進(jìn)行組裝，并最終使用CISA[9]軟件進(jìn)行整合；用gapclose(Version：1.12)等軟件對(duì)初步組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和補(bǔ)洞，從而得到最終組裝結(jié)果。具體測(cè)序和組裝過程由北京諾禾致源公司完成。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到組裝好的基因組序列上，通過統(tǒng)計(jì)組裝序列的GC含量和測(cè)序深度，總結(jié)基因組的GC偏向性和重復(fù)序列情況。分別將組裝好的序列上傳至核糖體多位點(diǎn)序列分型(ribosomal multilocus sequence typing，rMLST)數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/species-id)及JspeciesWS數(shù)據(jù)庫(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)，進(jìn)行菌種識(shí)別和平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)分析。用GeneMarkS軟件進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)及過濾，使用Diamond軟件將目標(biāo)物種的氨基酸序列與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Non-Redundant Protein Database，NR)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)注釋進(jìn)行比對(duì)，可進(jìn)一步得到物種信息[10]。

1.8毒力基因分析 用Diamond軟件，將目標(biāo)物種的氨基酸序列分別與VFDB數(shù)據(jù)庫[11](Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，http://www.mgc.ac.cn/VFs)和PHI數(shù)據(jù)庫[12](Pathogen-Host Interactions databas，http://www.phi-base.org)進(jìn)行比對(duì)，將目標(biāo)物種的基因和其相對(duì)應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來，得到毒力基因注釋結(jié)果。

1.9多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 將組裝好的測(cè)序文件與PubMLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/vcholerae/)中相應(yīng)的7個(gè)管家基因adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC進(jìn)行序列比對(duì)，從而確定其序列型(sequence type，ST)。根據(jù)該菌株的ST，用PubMLST數(shù)據(jù)庫對(duì)該菌株最小生成樹進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌形態(tài)特征 口腔拭子接種于血瓊脂平板經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18～24 h后見可疑菌落生長。取該菌落涂片革蘭染色，鏡下顯示革蘭陰性微彎曲的桿菌(圖1A)。該菌落轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板和TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，該菌在2種培養(yǎng)基中均生長良好，血瓊脂平板上菌落較大，呈灰綠色、有β溶血環(huán)的濕潤菌落(圖1B)，在TCBS平板上呈黃色大而濕潤的菌落(圖1C)。

注：A，革蘭染色；B，血瓊脂平板；C，TCBS平板。

2.2質(zhì)譜鑒定與血清群分型 菌株經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定為霍亂弧菌，鑒定分值為2.151。血清凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清均未發(fā)生凝集反應(yīng)，鑒定為NOVC。

2.3分子生物學(xué)鑒定 測(cè)序深度和覆蓋度顯示該樣品平均測(cè)序深度213，覆蓋度99.99%，測(cè)得DNA長度為4 018 291 bp，GC含量為44.93%。GC-Depth分析顯示，該樣品測(cè)序擴(kuò)增時(shí)不存在明顯的GC偏向，組裝中無明顯的錯(cuò)配及污染序列，見圖2A。將組裝好的序列上傳至PubMLST網(wǎng)站的rMLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行菌種識(shí)別，結(jié)果顯示上傳序列與霍亂弧菌吻合度為100%。將序列上傳至JspeciesWS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ANI分析，ANIb值為96.05%，ANIm值為96.56%。將測(cè)序序列用NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋，共得到霍亂弧菌相關(guān)的基因2 981個(gè)，見圖2B。

注：A，GC-Depth分析；B，NR注釋分析。

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果 該菌對(duì)哌拉西林中度敏感，對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南均敏感。

2.5毒力基因分析 基因組重測(cè)序結(jié)果顯示，該菌株不存在ctxAB、tcpA、zonulaoccludenstoxin(zot)、accessorycholeraenterotoxin(ace)及st等毒力基因，毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxinregulatorygene，toxR)、hlyA、唾液酸酶基因(neuraminidaseH，nanH)、hapA、甘露醇敏感血凝素(mannosesensitivehemagglutinationA，mshA)、外膜蛋白粘附因子(outermembraneproteinU，ompU)、rtxC以及T6SS等基因?yàn)殛栃浴?/p>

2.6MLST分型 該菌株7個(gè)管家基因在數(shù)據(jù)庫內(nèi)均能找到相對(duì)應(yīng)的等位基因數(shù)值，分別為adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM6、pyrC29，但未有對(duì)應(yīng)的序列分型。將原始的測(cè)序結(jié)果及整理后的堿基序列提交PubMLST網(wǎng)站，得到新的ST型為ST-986，并進(jìn)行最小生成樹分析。見圖3。

注：ST顯示為圓圈，每個(gè)圓圈的大小表示此特定類型中分離株的數(shù)量；2個(gè)圓圈之間的線上的數(shù)字代表2種類型的不同數(shù)量。

3 討論

該患者以腹瀉、腹痛伴發(fā)熱起病，并很快出現(xiàn)口腔感染癥狀?；颊咴诋?dāng)?shù)蒯t(yī)院經(jīng)抗菌藥物治療后腹痛、腹瀉好轉(zhuǎn)，為繼續(xù)治療放化療引起的繼發(fā)性血小板減少入住我院。入院后口腔拭子細(xì)菌培養(yǎng)檢出NOVC。研究表明，由NOVC引起的感染在免疫缺陷患者中更為常見，特別是肝硬化、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤患者[2]。本病例為食管癌術(shù)后放化療患者，屬NOVC高危易感人群。放化療導(dǎo)致的骨髓抑制、免疫力低下和口腔黏膜損傷可能是患者口腔感染NOVC的重要原因?；颊咂饺障彩臭~蝦，考慮本病例中感染的NOVC可能來源于受污染的食物。

NOVC口腔感染雖然不會(huì)致命，但可引起患者口腔疼痛，影響進(jìn)食，降低患者生活質(zhì)量。研究表明，Bruker Biotyper MALDI-TOF MS系統(tǒng)具有準(zhǔn)確識(shí)別致病性弧菌種類的能力[13]。本研究首先通過該技術(shù)快速地從物種水平鑒定為霍亂弧菌。rMLST是一種基于核糖體的多位點(diǎn)序列分型，可進(jìn)行菌種識(shí)別[14]。ANI即平均核苷酸一致性，主要用于在全基因組水平評(píng)估物種間的親緣關(guān)系，ANI值超過95%被視為界定種的標(biāo)準(zhǔn)[15]。NR數(shù)據(jù)庫可以把目標(biāo)物種的基因和其相對(duì)應(yīng)的功能注釋信息結(jié)合起來[10]。我們通過rMLST、ANI分析和NR比對(duì)，進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度證實(shí)該菌為霍亂弧菌。

在本研究中，該菌株對(duì)臨床常用的抗菌藥物均敏感，患者經(jīng)過頭孢哌酮/舒巴坦治療恢復(fù)良好。該患者入院后的大便培養(yǎng)和血液培養(yǎng)中均未檢出霍亂弧菌，可能與患者入院前經(jīng)過了一段時(shí)間的抗菌藥物治療有關(guān)。同時(shí)，該患者在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療時(shí)未行大便培養(yǎng)，因此錯(cuò)失了從大便中分離出霍亂弧菌的機(jī)會(huì)。國內(nèi)Wu等[16]報(bào)道已有少數(shù)NOVC菌株攜帶編碼超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBL)基因而對(duì)第三代頭孢菌素耐藥現(xiàn)象。印度和越南的研究顯示，臨床和環(huán)境中分離的NOVC菌株已經(jīng)出現(xiàn)NDM-1金屬酶介導(dǎo)的碳青霉烯酶抗性[17]。因此，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果制定治療方案仍然十分重要。

雖然本文檢出菌株缺乏ctxAB、tcpA、zot、ace及st等主要毒力基因，但其含有可能編碼其他輔助毒力因子的基因，如toxR、hlyA、nanH、hapA、mshA、ompU、rtxC以及T6SS等。這些毒力因子可能提高該菌株的致病性，并在感染過程中發(fā)揮協(xié)同作用。由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫毒力基因信息數(shù)量的局限，該菌株是否存在其他的毒力基因仍需進(jìn)一步分析，每種已知的毒力基因在患者口腔感染中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，我們還進(jìn)一步通過MLST對(duì)該菌株進(jìn)行研究，以確定其遺傳異質(zhì)性。MLST結(jié)果表明我們鑒定的NOVC為新的序列型(ST986)。該菌株與我國最為流行的ST80(adk2、gyrB5、mdh45、metE56、pntA6、purM36、pyrC51)有6個(gè)基因座差異，可引起散發(fā)感染。Luo等[18]報(bào)道ST80是我國浙江省腹瀉患者糞便中分離的NOVC菌株優(yōu)勢(shì)克隆。在PubMLST數(shù)據(jù)庫中，與該菌株最相似的ST是ST209(adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM11、pyrC29)，該型首次在我國山東省發(fā)現(xiàn)，分離自膽汁標(biāo)本；另有1株分離自痰培養(yǎng)標(biāo)本的NOVC(ST210)，與本株進(jìn)化上有較大差異。由此可見，NOVC的序列類型可能在我國具有明顯的地域特征。

綜上所述，本研究檢出1株ST-986的新型非O1/O139群霍亂弧菌，揭示腫瘤化療患者口腔感染該型NOVC的可能性，并提示一些輔助毒力因子可能在該菌株的致病性中起重要作用。雖然NOVC引起的口腔感染罕見，但臨床醫(yī)生應(yīng)警惕免疫力低下患者感染這種病原體的可能性。