王曙東， 馬 倩， 王 可,4， 瞿才新， 戚 玉

(1. 鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 紡織服裝學(xué)院， 江蘇 鹽城 224005； 2. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215002；3. 江蘇金麥穗新能源科技股份有限公司， 江蘇 鹽城 224005； 4. 青島大學(xué) 紡織服裝學(xué)院， 山東 青島 262127)

組織工程支架材料融合了材料工程和生命科學(xué)的概念和創(chuàng)新，旨在解決組織的改進(jìn)、修復(fù)和替換問(wèn)題[1]。為成功地進(jìn)行組織的修復(fù)和再生，支架材料應(yīng)具有特定形狀、三維多孔結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的生物力學(xué)特性，并可為細(xì)胞的附著、增殖和分化提供支持[2]。蠶絲蛋白因具有良好的生物相容性、生物可降解性以及最小的炎癥反應(yīng)等優(yōu)異性能，已被制備成多種結(jié)構(gòu)和形態(tài)的支架材料，如水凝膠、納米纖維、薄膜、微球和管狀物等，并廣泛應(yīng)用于組織工程的修復(fù)與再生[3-4]。目前，靜電紡絲法、自組裝法、相分離法、氣體發(fā)泡法、溶膠-凝膠法等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架的制備[5]。除上述方法外，3D打印技術(shù)以其成型簡(jiǎn)單、速度快、結(jié)構(gòu)可控、制備工藝更清潔等特點(diǎn)，引起了研究人員的廣泛關(guān)注[6-8]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有采用3D打印技術(shù)制備蠶絲蛋白支架的相關(guān)報(bào)道。SKANDER等[9]成功地在塑料基板上將蠶絲蛋白水溶液打印成平行線狀圖案，并將人體骨髓基質(zhì)細(xì)胞種植于該蠶絲蛋白線上，結(jié)果表明，細(xì)胞可較好地在該蠶絲蛋白線上生長(zhǎng)。GHOSH等[10]采用3D打印技術(shù)制備了格柵狀蠶絲蛋白支架材料，并將打印出的格柵狀蠶絲蛋白支架沉積到甲醇溶液中，通過(guò)有機(jī)醇交聯(lián)使蠶絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而使蠶絲蛋白水溶液凝膠成型。上述研究表明，蠶絲蛋白已被作為3D打印的潛在材料，并應(yīng)用于組織工程支架，然而3D打印制備蠶絲蛋白支架材料也面臨著挑戰(zhàn)，其中關(guān)鍵的問(wèn)題是蠶絲蛋白的快速成型與凝固，因?yàn)榭焖俪尚褪?D打印蠶絲蛋白支架材料的前提和基礎(chǔ)。

在課題組前期研究中，通過(guò)電凝膠法制備了蠶絲蛋白水凝膠，并通過(guò)有機(jī)醇處理和紫外光固化等方法研究了蠶絲蛋白水凝膠的快速成型[11]，但制備過(guò)程復(fù)雜，且有機(jī)醇和光固化劑等可能會(huì)對(duì)蠶絲蛋白支架材料造成污染。明膠是一種從膠原蛋白中提取的可生物降解的聚合物，其成分和生物特性與膠原蛋白幾乎相同，此外，在低溫環(huán)境下明膠可快速凝膠成型[12]，因此，本文將蠶絲蛋白與明膠復(fù)合，制備了蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠，通過(guò)明膠來(lái)調(diào)節(jié)蠶絲蛋白的快速成型，通過(guò)直寫擠出式3D打印技術(shù)制備了格柵狀蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架，并對(duì)其結(jié)構(gòu)與性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶繭，市售；明膠粉(平均相對(duì)分子質(zhì)量為25 000，化學(xué)純)，溴化鋰、碳酸氫鈉、無(wú)水乙醇、胭脂紅、苦味酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為7 000)，上?；巧锟萍加邢薰?；MC3T3-E1胚胎成骨細(xì)胞，由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的制備

剪碎的蠶繭經(jīng)脫膠、溶解、透析等過(guò)程制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%的蠶絲蛋白水溶液[13]，并置于4 ℃條件下保存待用。將明膠粉在60 ℃的蒸餾水中溶解，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的明膠水溶液。將制備的蠶絲蛋白水溶液與明膠水溶液按照一定的質(zhì)量比(100∶0、70∶30、50∶50、30∶70和0∶100)混合，得到不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水溶液。

采用自組裝的直寫擠出式3D打印設(shè)備在4 ℃環(huán)境下，將蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水溶液通過(guò)打印噴頭打印到固定的表面皿上，打印出具有三維周期結(jié)構(gòu)格柵狀蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠。打印噴頭采用內(nèi)徑為0.9 mm的錐形注射器針頭。將打印好的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠置于-20 ℃下12 h后，放置在凍干機(jī)中48 h獲得凍干支架樣品[14]。

1.3 結(jié)構(gòu)與性能測(cè)試

采用RS6000型流變儀(德國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)測(cè)定蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的黏度、儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)等流變性能[15]。實(shí)驗(yàn)使用的PP20H型平行板直徑為20 mm，平行板間距為0.5 mm，在頻率為1 Hz和溫度為4 ℃條件下進(jìn)行掃描測(cè)試。

采用3365型電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(美國(guó)英斯特朗公司)測(cè)定蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架的拉伸力學(xué)性能，并獲得相應(yīng)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線[16]。

采用Jasco-815型圓二色光譜儀(CD，日本分光株式會(huì)社)測(cè)定蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)，掃描波長(zhǎng)范圍為250～190 nm，掃描速率為100 nm/min。

采用Nicolet5700型傅里葉紅外光譜儀(FT-IR，美國(guó)尼高力儀器公司)測(cè)試蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的紅外光譜圖，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

采用X′Pert-Pro MRD型X射線衍射儀(XRD，荷蘭帕納科公司)測(cè)試蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的衍射圖譜，掃描范圍為5°～45°。

采用S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立公司)觀察凍干后的蠶絲蛋白/明膠格柵狀支架的結(jié)構(gòu)。

采用MC3T3-E1胚胎成骨細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)表征蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的生物相容性。將MC3T3-E1細(xì)胞分散于培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)傳代使用。將格柵狀蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架高溫滅菌后，在支架上種植MC3T3-E1細(xì)胞，采用四唑鹽比色法(MTT)測(cè)定細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況，借助掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)形貌[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的流變性能

圖1(a)示出蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠在4 ℃下的外觀形態(tài)?？梢姡杭冃Q絲蛋白呈溶液狀態(tài)，當(dāng)蠶絲蛋白與明膠質(zhì)量比為70∶30時(shí)，已呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)；隨著明膠質(zhì)量占比的提高，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的凝膠效果越來(lái)越好，其對(duì)應(yīng)的黏度測(cè)試結(jié)果如圖1(b)所示?？梢姡S著明膠質(zhì)量比的提高，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的黏度逐漸增加，表明明膠的復(fù)合有利于提升蠶絲蛋白水溶液的凝膠成型效果。

圖1 不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的外觀形貌和流變性能Fig.1 Morphology (a) and rheological property (b) of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratios

為進(jìn)一步研究蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的凝膠成型性能，測(cè)試了它的儲(chǔ)能模量和損耗模量，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)儲(chǔ)能模量小于損耗模量時(shí)，流體表現(xiàn)為液體狀態(tài)；當(dāng)儲(chǔ)能模量大于損耗模量時(shí)，流體表現(xiàn)為凝膠狀態(tài)[18]。由圖2(a)可見：純蠶絲蛋白體系的損耗模量大于儲(chǔ)能模量，體系呈現(xiàn)為溶液狀態(tài)，不利于3D打印快速凝膠成型；隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合體系的儲(chǔ)能模量逐漸增大，儲(chǔ)能模量逐漸大于損耗模量，復(fù)合體系呈現(xiàn)膠體狀，且隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合體系的膠體性能變好，有利于3D打印過(guò)程中的快速凝膠成型。

圖2 不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量Fig.2 Elastic shear and viscous moduli of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratio

2.2 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能

蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架的拉伸力學(xué)性能如圖3所示。可見：純蠶絲蛋白支架的斷裂強(qiáng)度較小，為0.87 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為55.63%；隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合水凝膠支架的斷裂強(qiáng)度逐漸增大，斷裂伸長(zhǎng)率有一定程度的降低；當(dāng)蠶絲蛋白與明膠質(zhì)量比為50∶50時(shí)，復(fù)合水凝膠支架的斷裂強(qiáng)度為3.43 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為45.64%。這可能是由于隨著復(fù)合水凝膠中明膠質(zhì)量占比的提高，復(fù)合水凝膠的黏度和儲(chǔ)能模量逐步增加的緣故。另外，因蠶絲纖維在溶解過(guò)程中蛋白質(zhì)大分子鏈被切斷，分子質(zhì)量變小，導(dǎo)致明膠蛋白的分子質(zhì)量高于蠶絲蛋白，也是導(dǎo)致隨著明膠復(fù)合比例的提高，復(fù)合水凝膠的斷裂強(qiáng)度逐漸提高的原因。

圖3 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin/gelatin blended hydrogel

2.3 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的圓二色光譜、紅外光譜和X射線衍射圖譜如圖4所示。由圖4(a)可見：蠶絲蛋白水溶液的圓二色光譜圖在195 nm處有吸收峰，屬于蠶絲蛋白silk I結(jié)構(gòu)特征峰，表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主[19]。蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠在197～198 nm處出現(xiàn)吸收峰，同屬于蠶絲蛋白silk I結(jié)構(gòu)特征峰，表明蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是以無(wú)規(guī)卷曲為主，說(shuō)明明膠的復(fù)合未對(duì)蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

由圖4(b)可見：蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的紅外光譜在1 652～1 640 cm-1(酰胺I)和1 537 cm-1(酰胺II)處均有明顯的吸收峰，在1 237 cm-1(酰胺III)處有中等強(qiáng)度的吸收峰，表明蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)卷曲為主[20]。此外，純蠶絲蛋白在酰胺I上的吸收峰在1 652 cm-1處，隨著明膠質(zhì)量占比的增加，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠酰胺I上的特征吸收峰向低波數(shù)偏移，且隨著明膠質(zhì)量占比的提高，吸收峰向低波數(shù)方向偏移幅度變大；當(dāng)蠶絲蛋白和明膠質(zhì)量比為30∶70時(shí)，在酰胺I處出現(xiàn)2處特征吸收峰，分別在1 643和1 635 cm-1處，表明隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合水凝膠體系的部分無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這是由于蠶絲蛋白與明膠形成氫鍵所致[21]。

圖4 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Microstructure of silk fibroin/gelatin blended hydrogel.(a) Circular dichroism spectra; (b) FT-IR spectra; (c) XRD spectra

由圖4(c)可見：蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合凝膠XRD圖譜均在20.6°附近出現(xiàn)比較寬的散射峰，沒有出現(xiàn)明顯的衍射峰。表明蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠的復(fù)合水凝膠均以無(wú)定形結(jié)構(gòu)為主[22]，明膠對(duì)蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生影響，這與圓二色光譜和紅外光譜的分析結(jié)果是一致的。

2.4 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的形貌結(jié)構(gòu)

3D打印蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠及其凍干后的支架形貌結(jié)構(gòu)如圖5、6所示。由圖5可見：純蠶絲蛋白溶液體系通過(guò)打印針頭打印出后是溶液狀，不能成型；隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合水凝膠的黏度增大，可成功打印出格柵狀蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠；當(dāng)蠶絲蛋白與明膠質(zhì)量比為50∶50時(shí)，可打印出成型較好、線條較規(guī)整的復(fù)合水凝膠。但隨著明膠質(zhì)量占比的進(jìn)一步增加，復(fù)合水凝膠的黏度進(jìn)一步增大，不易從針頭擠出，成型效果變差(見圖5(d))；而純明膠水凝膠(見圖5(e))由于其黏度太大，不易從打印針頭擠出。將上述打印好的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠冷凍干燥，得到蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架，當(dāng)蠶絲蛋白與明膠質(zhì)量比為50∶50時(shí)，可得到成型效果較好、線條規(guī)整的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架(見圖6(c))；隨著明膠質(zhì)量占比的進(jìn)一步增大，凍干支架的成型效果變差。綜上所述，在3D打印蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠時(shí)，采用蠶絲蛋白與明膠的質(zhì)量比為50∶50時(shí)較佳。

圖5 不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架形貌Fig.5 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels scaffolds with different blended ratios

經(jīng)凍干后的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架的掃描電鏡照片如圖7所示?？梢姡盒Q絲蛋白支架及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架均呈現(xiàn)蜂窩狀的多孔結(jié)構(gòu)，純蠶絲蛋白支架的多孔結(jié)構(gòu)較為緊湊；蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架的孔隙尺寸逐步變大，說(shuō)明明膠的復(fù)合在一定程度上改善了復(fù)合水凝膠體系的多孔結(jié)構(gòu)，這對(duì)后續(xù)支架的細(xì)胞培養(yǎng)是有利的。

圖6 不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干后支架形貌Fig.6 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels freeze-dried scaffolds with different blended ratios

圖7 不同質(zhì)量比的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠凍干支架SEM照片(×100)Fig.7 SEM images of freeze-dried silk fibroin/gelatin blended hydrogel scaffolds with different blended ratios(×100)

2.5 蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠細(xì)胞相容性

MC3T3-E1細(xì)胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠(50∶50)復(fù)合水凝膠支架上培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞增殖情況如表1所示?？梢姡琈C3T3-E1細(xì)胞在2種支架上均可較好地生長(zhǎng)和增殖，這是因?yàn)樾Q絲蛋白具有優(yōu)異的生物相容性，且支架的多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。細(xì)胞在蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架上的增殖情況要好于純蠶絲蛋白水凝膠支架。這是因?yàn)槊髂z的復(fù)合在一定程度上改善了支架的多孔結(jié)構(gòu)，且明膠是一種活性蛋白[23]。細(xì)胞在2種支架上培養(yǎng)7 d后的生長(zhǎng)情況如圖8所示?？梢?，培養(yǎng)7 d后，MC3T3-E1細(xì)胞以層狀覆蓋于支架的表面，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且細(xì)胞在復(fù)合水凝膠支架上已連成片狀，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化情況良好，這與MTT分析結(jié)果是一致的。上述結(jié)果表明，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架具有良好的生物相容性。

表1 MC3T3-E1細(xì)胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架上的增殖情況Tab.1 Proliferation of MC3T3-E1 cell on silk fibroin and silk fibroin/gelatin scaffolds

圖8 MC3T3-E1細(xì)胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架上培養(yǎng)7 d后的掃描電鏡照片(×200)Fig.8 SEM images of MC3T3-E1 cell on silk fibroinscaffolds (a) and silk fibroin/gelatin scaffolds (b) after 7 days culturing(×200)

3 結(jié) 論

本文將蠶絲蛋白與明膠復(fù)合，通過(guò)明膠來(lái)調(diào)節(jié)蠶絲蛋白的快速凝膠成型，并通過(guò)直寫擠出式3D打印裝置制備了格柵狀蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠，研究了其結(jié)構(gòu)與生物相容性，得出如下主要結(jié)論。

1)明膠的復(fù)合改善了蠶絲蛋白的流變性能，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的黏度隨著明膠質(zhì)量比的增加而增加，其儲(chǔ)能模量大于損失模量，呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，有利于后續(xù)3D打印過(guò)程中的快速凝膠成型。當(dāng)蠶絲蛋白與明膠質(zhì)量比為50∶50時(shí)，可打印出成型較好、線條較規(guī)整的復(fù)合水凝膠；但隨著明膠質(zhì)量占比的進(jìn)一步提高，打印效果變差。凍干后的蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架呈現(xiàn)蜂窩狀的多孔結(jié)構(gòu)。

2)蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主，明膠的復(fù)合對(duì)蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生明顯的影響，但二者之間存在氫鍵結(jié)合，使得復(fù)合水凝膠的部分無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。明膠的復(fù)合提升了蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架的力學(xué)性能，且隨著明膠質(zhì)量占比的增加，復(fù)合水凝膠支架的斷裂強(qiáng)度逐漸增加。

3)MC3T3-E1細(xì)胞可在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架上生長(zhǎng)和增殖，蠶絲蛋白/明膠復(fù)合水凝膠支架上增殖情況要好于純蠶絲蛋白支架；培養(yǎng)7 d后，MC3T3-E1細(xì)胞以層覆蓋于復(fù)合支架表面，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化情況良好。