劉克強，譚健，張衛(wèi)強，馬靜波，趙京

1.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心 胸外科，北京 100700；2.南方醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510280

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率較高，轉(zhuǎn)移性強往往是肺癌死亡率高的因素之一[1-2]。癌癥轉(zhuǎn)移由一系列敏感地依賴于細(xì)胞遷移能力的過程組成，在局部組織浸潤時，癌細(xì)胞通過腫瘤間質(zhì)和血管遷移，到達(dá)并生長在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位。銅是腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成所必需的，細(xì)胞銅代謝受銅轉(zhuǎn)運蛋白和伴侶蛋白網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)[3]，與正常組織比較發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中銅的含量更高[4]。

Atox1是細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運的重要伴侶蛋白。人Atox1是一種相對分子質(zhì)量為7400的可溶性蛋白質(zhì)，折疊成鐵氧化還原蛋白樣βαββα結(jié)構(gòu)[5]。過去幾年，大部分研究焦點集中在Atox1作為銅伴侶的功能上。Atox1的主要功能是將銅輸送到ATP7A和ATP7B[6]，這種生理過程對細(xì)胞維持銅穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Atox1的失活或缺失將導(dǎo)致銅結(jié)合分泌酶（PAM）的不成熟[7]。目前多數(shù)關(guān)于Atox1的研究都是基于Atox1-ATP7A/B銅轉(zhuǎn)移模型，例如 Menkes和 Wilson 病[8]、順鉑耐藥[3]、神經(jīng)元分化和血管損傷后的新內(nèi)膜形成[9]等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Atox1在乳腺癌、結(jié)直腸癌、子宮癌、肝癌等癌癥中上調(diào)，與患者生存率和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-4,9-11]。

本研究主要探討Atox1在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系及非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)特點及其對細(xì)胞增殖和遷移的影響，初步闡明Atox1在肺癌中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（NCI-H292、95-D）、非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（A549）、正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；pCMV-Atox1購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；pCMV-Atox1突變型表達(dá)載體由北京海創(chuàng)科業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建；Atox1-shRNA慢病毒的構(gòu)建和包裝由北京基石生命科技有限公司完成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green染料購自TaKaRa公司；Atox1引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Atox1抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；Transwell小室購自康寧公司；F12K培養(yǎng)基購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按培養(yǎng)基∶血清為9∶1配置完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系NCI-H292、95-D和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549采用F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱為細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用LipofectAMINE 3000。6孔板中，每孔siRNA濃度為20 nmol/L，質(zhì)粒用量8 μg/孔，轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 UALCAN在線分析Atox1在肺癌組織中的表達(dá)量

采用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）分析Atox1在肺癌組織及癌旁組織中的差異表達(dá)。

1.4 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol提取組織或細(xì)胞中的RNA，冰上裂解5～10 min后加入氯仿，混勻，靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心沉淀RNA，吸取上清液至新的EP管中并棄去沉淀，加入等體積異丙醇，4℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，加入75%酒精充分洗滌沉淀，離心去除上清液，將RNA樣品沉淀至于超凈臺干燥5 min，加入DEPC水溶解，Nanodrop測量總RNA濃度，-80℃保存。

將提取的RNA樣品置于冰上，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，得到的cDNA樣品于-20℃保存待用。

1.5 qRT-PCR實驗

采用染料法試劑盒進行熒光定量PCR擴增實驗。Atox1正向引物為5′-CTCAGTCATGCCGA AGCA-3′，反向引物為 5′-CTTCAGGGTTGCAAGC AGAG-3′；GAPDH 正向引物為 5′-AGAAGGCTGG GGCTCATTTG-3′，反向引 物 為 5′-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3′。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

冰上裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，向蛋白樣品中加入上樣緩沖液，進行SDS-PAGE。接著進行恒流轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，4℃孵一抗過夜，次日進行二抗常溫孵育，二抗孵育完成后加入化學(xué)發(fā)光液與蛋白條帶反應(yīng)，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.7 細(xì)胞增殖檢測

按1×104/孔接種細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長覆蓋率達(dá)50%左右，用LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞并持續(xù)培養(yǎng)4 d。分別于不同時間點，棄去培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)基配置的10%CCK-8反應(yīng)液，37℃恒溫培養(yǎng)40 min，酶標(biāo)儀檢測D450nm值。

1.8 細(xì)胞遷移檢測

將轉(zhuǎn)染后24 h的5×104各組細(xì)胞接種至Transwell的上室，下室分別加入800 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，用PBS清洗3次，甲醇固定15 min，DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個以上視野拍照計數(shù)。

1.9 Atox1穩(wěn)定敲低細(xì)胞株的建立

接種狀態(tài)良好的NCI-H292細(xì)胞至6孔板中，密度為60%～80%，待細(xì)胞貼壁后，按照病毒定量結(jié)果加入病毒上清液，6 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后加入2.0 μg/mL新霉素，繼續(xù)篩選培養(yǎng)2周至單克隆細(xì)胞群形成。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 7.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，Shapiro-Wilk檢測實驗數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。多組間均值差異采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩分析采用LSD-t，雙因素組間均值差異采用雙因素方差分析，檢測水準(zhǔn)α＜0.05雙側(cè)，實驗均重復(fù)3次以上，P＜0.05表示顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Atox1在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)分析

UALCAN在線分析肺癌組織與癌旁組織中Atox1的表達(dá)量，結(jié)果如圖1A，肺癌組織中Atox1的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。采用qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（NCI-H292、95-D）、非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（A549）及正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中Atox1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖1B、C。Shapiro-Wilk檢測實驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，S-WNCI-H292=0.995，PNCI-H292=0.859；SW95-D=0.838，P95-D=0.208；S-WA549=0.893，PA549=0.363；S-WHCC827=0.993，PHCC827=0.843。NCI-H292、95-D、A549和HCC827中Atox1的mRNA相對表達(dá)量分別為1.000±0.070、0.970±0.101、0.640±0.063、0.530±0.056，F(xiàn)=29.97，P＜0.01；轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（NCI-H292，95-D）的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系（A549）和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 Atox1在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)分析

2.2 敲低Atox1抑制NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移能力

在NCI-H292細(xì)胞中用siRNA敲低Atox1，利用qPCR和蛋白印跡分別檢測Atox1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2A，相比si-NC組，si-Atox1組蛋白表達(dá)量顯著降低。采用CCK-8檢測敲低Atox1對NCI-H292細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖2B，24、48及72 h si-Atox1組細(xì)胞增殖能力明顯低于si-NC組。Transwell檢測敲低Atox1對NCI-H292細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果如圖2C、D，si-Atox1組細(xì)胞遷移能力顯著低于si-NC組。綜上，通過抑制Atox1的表達(dá)能夠下調(diào)NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移能力。

2.3 過表達(dá)Atox1促進A549細(xì)胞增殖和遷移能力

在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCMV-control和pCMVAtox1質(zhì)粒，蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖3A，相比對照組，Atox1組蛋白表達(dá)量顯著增加。采用CCK-8檢測過表達(dá)Atox1對A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖3B，Atox1過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯高于對照組。Transwell檢測過表達(dá)Atox1對A549細(xì)胞遷移能力的影響，Atox1過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力明顯高于對照質(zhì)粒組（圖3C、D）。綜上，過表達(dá)Atox1能夠增加A549細(xì)胞增殖和遷移能力。

2.4 Atox1的亞細(xì)胞定位影響其功能

Atox1早期作為銅分子伴侶被大量研究，但最近研究發(fā)現(xiàn)Atox1還具有轉(zhuǎn)錄因子活性。Atox1對NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控是否依賴于其轉(zhuǎn)錄活性呢？首先，我們利用Atox1-shRNA慢病毒載體建立Atox1穩(wěn)定敲除的NCI-H292細(xì)胞株（圖4A）。Atox1如果發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性，必然會依賴于其核定位信號進入細(xì)胞核。因此，我們分別構(gòu)建了野生型和缺失核定位信號（KKTGK）[12]的突變型Atox1過表達(dá)載體（圖4B）。野生型Atox1在穩(wěn)定敲除細(xì)胞株中主要定位于細(xì)胞核，而突變型Atox1則集中定位于細(xì)胞質(zhì)（圖4C）。野生型Atox1能夠促進細(xì)胞增殖和遷移，而突變型Atox1的這種促進效應(yīng)顯著下調(diào)（圖5A、B）。以上結(jié)果揭示Atox1對NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控可能與自身亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。

3 討論

圖2 敲低Atox1對NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

大多數(shù)肺癌患者死于癌癥轉(zhuǎn)移擴散，迫切需要探索新的治療方法，提高肺癌治療效果。在過去10年，肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了基因組分子激活突變，并衍生出針對特異性突變的分子療法，使得某些晚期肺癌患者顯著提高了生存率[2,13]。

研究表明，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與代謝變化有關(guān)，調(diào)節(jié)腫瘤代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的許多分子已被作為分子癌癥治療靶點加以研究[3,14]。除了葡萄糖代謝的變化外，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化還與其他代謝途徑的變化有關(guān)，包括蛋白質(zhì)合成、脂肪酸代謝和金屬代謝，如銅代謝。Atox1是細(xì)胞中可以與銅結(jié)合的伴侶蛋白，參與促進細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因周期蛋白D1的表達(dá)，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[10]。最初體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)銅能夠刺激小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，并顯著促進細(xì)胞增殖、周期蛋白D1表達(dá)和進入S期，而Atox1-/-組則抵消了這些作用[12]。研究表明，在癌癥和動脈粥樣硬化的增生性病變中，細(xì)胞核中的銅含量高于正常組織。Blockhuys等研究發(fā)現(xiàn)Atox1聚集在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的板狀偽足邊界，并且Atox1的沉默導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移缺陷，表明Atox1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用[15]。為了揭示Atox1在細(xì)胞遷移中的可能作用，他們后續(xù)探究了Atox1促進乳腺癌細(xì)胞遷移的作用機制，發(fā)現(xiàn)Atox1通過ATP7A-LOX軸上的銅協(xié)調(diào)運輸介導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞的遷移，Atox1可能是轉(zhuǎn)移潛能的預(yù)測指標(biāo)，并可作為銅治療的生物標(biāo)志物[10]。此外，通過沉默Atox1能夠增加一些抗癌治療藥物比如銅螯合劑的敏感性，激活細(xì)胞凋亡通路[16]。

圖3 過表達(dá)Atox1對A549細(xì)胞增殖和遷移能力影響

圖4 過表達(dá)野生型和缺失核定位信號的突變型Atox1

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Atox1除作為銅伴侶蛋白外還具有轉(zhuǎn)錄因子的活性。Atox1能夠依靠C端高度保守的核定位信號序列KKTGK進入細(xì)胞核，在銅離子存在的情況下結(jié)合到周期蛋白D1的GAAAGA啟動子區(qū)域，提高其mRNA和蛋白表達(dá)水平,從而影響銅誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖[12]。Atox1能與位于細(xì)胞外基質(zhì)的超氧化物歧化酶SOD3的啟動子區(qū)GAAAGA序列結(jié)合，調(diào)控SOD3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響細(xì)胞外超氧陰離子自由基的水平，影響血管氧化應(yīng)激壓力，進而調(diào)控血壓和內(nèi)皮功能[17]。Jana等比較了轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞系SW620與其相關(guān)的非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系SW480中Atox1的細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)相比非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系SW480，轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞系SW620的Atox1核定位增加[4]。

本研究主要探究Atox1沉默對轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系及非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系增殖和遷移的影響。首先，通過在線預(yù)測Atox1在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)Atox1在肺癌組織中高表達(dá)。接著檢測了轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系及非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系中Atox1的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系中Atox1的mRNA和蛋白表達(dá)均高于非轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系。通過si-Atox1敲低NCI-H292細(xì)胞Atox1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)明顯降低了NCI-H292細(xì)胞增殖和遷移能力；而通過在A549細(xì)胞中過表達(dá)Atox1，發(fā)現(xiàn)明顯促進A549細(xì)胞細(xì)胞增殖和遷移能力。進一步，我們在穩(wěn)定敲除Atox1的NCI-H292細(xì)胞中回復(fù)表達(dá)野生型或缺失核定位信號的突變型Atox1，證明Atox1促細(xì)胞增殖和遷移能力與其細(xì)胞核定位密切相關(guān)，提示Atox1調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移能力與它的轉(zhuǎn)錄活性可能相關(guān)聯(lián)。

目前報道的Atox1作為轉(zhuǎn)錄因子主要與GAAAGA啟動子區(qū)域相互作用，而GAAAGA序列在不同物種中具有高度保守性[18]。下一步，我們需要借助生物信息學(xué)確定Atox1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在靶標(biāo)，進一步深入分析Atox1在肺癌細(xì)胞中調(diào)控通路。Atox1作為銅伴侶蛋白維持細(xì)胞內(nèi)銅離子平衡,同時可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，響應(yīng)細(xì)胞中多種功能性調(diào)控機制。因此,詳細(xì)理解Atox1在細(xì)胞中的功能具有重要的生物學(xué)意義。

圖5 野生型與突變型Atox1的功能差異