王俊力， 楊 運， 邵 衛(wèi)， 羅衛(wèi)東， 張忠文， 梅俊華， 陳國華

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

毒邪作為一類重要的致病因素，既可由外侵入，又可由內(nèi)產(chǎn)生，與多種疾病的發(fā)生和演變密切相關。隨著分子生物學的發(fā)展，人們對毒邪致病的認識也在不斷深入，“內(nèi)生毒邪”的病因病機逐漸被廣為接受，如王永炎院士提出：“中風后常有瘀毒、痰毒、熱毒互結，破壞形體，損傷腦絡”，從而在對腦病的認識中形成了“毒損腦絡”的學術觀點[1]。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[2]是發(fā)生于老年和老年前期，以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，屬于中醫(yī)癡呆范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide，Aβ)在腦內(nèi)的過度沉積會激活小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生神經(jīng)免疫炎癥反應，引起神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常及氧化損傷，使tau蛋白過度磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結，導致膽堿神經(jīng)元選擇性丟失伴神經(jīng)遞質(zhì)分泌減少而出現(xiàn)臨床癡呆[3-6]，同時小膠質(zhì)細胞分泌的促炎細胞因子及炎性介質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的重要影響因素[7]。而對于AD的中醫(yī)病機，現(xiàn)代部分醫(yī)家認為腦為“清靈之府”，最忌穢氣濁毒，年邁體弱、臟腑虛衰再加外邪侵襲，人體臟腑功能失調(diào)，氣血津液運行失常，體內(nèi)的痰濁、瘀血等不能及時排出，郁蒸腐化，化熱成毒，濁毒內(nèi)生，毒損腦絡，導致腦竅壅塞、神機失用而發(fā)為癡呆[8-9]?，F(xiàn)代醫(yī)學的病理生理機制與中醫(yī)學的病因病機學說有不謀而合之處：Aβ沉積形成的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結，以及各種具有神經(jīng)元毒性的病理產(chǎn)物均屬于“內(nèi)生毒邪”范疇[10]。與毒邪相對應的中醫(yī)解毒治法應該具有明確的療效，目前的諸多研究也表明清熱解毒法能夠有效改善免疫炎癥反應所帶來的機體損害，然而這種毒邪及清熱解毒法在癡呆發(fā)病及治療中的作用機制仍不明確。因此本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導BV2小膠質(zhì)細胞活化建立體外神經(jīng)炎癥模型，探討黃連解毒湯含藥血清對神經(jīng)炎癥反應的保護作用，以期為清熱解毒法治療AD提供科學實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(250±20)g，購自三峽大學實驗動物中心，合格證號：No.42010200001292。BV2小膠質(zhì)細胞株購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(資源編號：3142 C0001000000337)。本實驗經(jīng)武漢市第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與主要試劑

中藥材黃連、黃芩、黃柏、梔子購于武漢市第一醫(yī)院中藥房(湖北天濟中藥飲片有限公司提供)，武漢市第一醫(yī)院制劑中心制作黃連解毒湯浸膏，本課題組質(zhì)控后備用；高糖DMEM培養(yǎng)液(貨號：SH30022.01)、青霉素和鏈霉素(貨號：SV30010)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA，貨號：SH30042.01)購于Hyclcone公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司(貨號：04-121-1)；NO檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司(貨號：S0024)；小鼠白細胞介素-6(IL-6)及白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒均購于深圳欣博盛生物科技有限公司(貨號：EMC004.96，EMC001b.96)；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ購于TaKaRa公司(貨號：D9108A，RR047A，RR820A)；兔來源MyD88多克隆抗體(分子量33 kD，貨號：AF5195，稀釋度1∶1000)、兔來源TLR4單克隆抗體(分子量95 kD，貨號：Ab13556，稀釋度1∶500)購于Affinity公司；兔來源NF-κB p65多克隆抗體(分子量65 kD，貨號：Ab16502，稀釋度1∶2000)、兔來源IκBa多克隆抗體(分子量36 kD，貨號：Ab7217，稀釋度1∶2000)、兔來源p-IκBa單克隆抗體(分子量35 kD，貨號：Ab133462，稀釋度1∶10000)、兔來源p-NF-κB p65多克隆抗體(分子量60 kD，貨號：Ab106129，稀釋度1∶1000)和兔來源GAPDH單克隆抗體(分子量36 kD，貨號：Ab181602，稀釋度1∶10000)均購于Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗(貨號：A21010)購于EARTH公司。

1.3 BV2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及分組處理

選用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞株，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，按照BV2小膠質(zhì)細胞生長情況，每隔1～2 d更換培養(yǎng)液。

取對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細胞，分為5組：10%空白大鼠血清組(Control組)、10%空白大鼠血清+LPS組(Control+LPS組)、黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)+LPS組(HLJDD+LPS組)；各組LPS濃度均為1 μg/mL，各HLJDD+LPS組用對應含藥血清預處理1 h后再加入LPS作用24 h，完成后續(xù)實驗。

1.4 黃連解毒湯含藥血清及大鼠對照血清制備

SPF級SD大鼠適應性喂養(yǎng)5 d，隨機分為大鼠對照血清組和黃連解毒湯組，每組10只，分別給予生理鹽水和黃連解毒湯灌胃(1 mL/100 g，2次/d)，連續(xù)6 d；第6天第1次給藥后1 h，以水合氯醛腹腔麻醉實驗大鼠，經(jīng)心臟采集全血并分組混勻，靜置1 h后3000 r/min離心15 min分離血清，56℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-70℃保存?zhèn)溆?；黃連解毒湯含藥血清以高糖DMEM培養(yǎng)液配制成5%、10%、20%濃度備用，大鼠對照血清以高糖DMEM培養(yǎng)液配制成5%濃度備用。

劑量換算：依據(jù)實驗動物與人的體表面積比例表[11]進行劑量換算，70 kg人的等效劑量相當于200 g大鼠的56倍，故黃連解毒湯組SD大鼠灌胃劑量=30÷56÷0.2=2.678(g/kg)。

1.5 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達

BV2小膠質(zhì)細胞接種于6孔板(2.5×105個/孔)中，細胞分組及處理同上。按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，經(jīng)分光光度計測定濃度和純度后，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應體積20 μL)。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為：95℃ 1 min預變性，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，循環(huán)40次；72℃末段延伸5 min。熔解曲線：72℃～95℃，每20 s升溫1℃。所用引物序列見表1，每組設3個復孔，使用GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達值。

表1 qPCR檢測所用引物序列Table 1 Primers used in qPCR detection

1.6 Western blot檢測TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白的表達

BV2小膠質(zhì)細胞接種到6孔板(2.5×105個/孔)中，按不同分組進行處理。各組棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次，加入蛋白酶抑制劑與RIPA裂解緩沖液的混合液提取各組細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴5 min變性。取各組蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉(0.5%TBST配制)常溫搖床封閉1 h。分別加入兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65抗體(各抗體稀釋倍數(shù)如前所述)，4℃孵育過夜。0.5% TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(抗體稀釋倍數(shù)如前所述)室溫下孵育30 min，0.5%TBST洗膜10 min×3次，加入等體積混勻的ECL化學發(fā)光試劑A和B，均勻滴加到膜的蛋白面，保持1～2 min后放入凝膠成像儀中曝光成像，應用Image J軟件進行各樣本條帶灰度值統(tǒng)計分析，結果以目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.7 ELISA法檢測IL-1β和IL-6含量

BV2小膠質(zhì)細胞接種到96孔板中(5×104/mL，每孔100 μL)，按不同分組進行處理。收集各組細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β和IL-6水平，具體操作按ELISA試劑盒說明書進行。用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，建立標準曲線，根據(jù)標準曲線計算細胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6的含量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達的影響

qPCR檢測結果顯示：與Control組比較，Control+LPS組細胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而不同濃度黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)預處理后，BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表達均受到抑制，與Control+LPS組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，且抑制作用在實驗濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性(圖1)。

2.2 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示：與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而與Control+LPS組比較，黃連解毒湯含藥血清預處理后的BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而與Control+LPS組比較，黃連解毒湯含藥血清預處理后的BV2小膠質(zhì)細胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖2)。

與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖1 熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達變化Fig.1 Fluorescent quantitative PCR for detection of relative mRNA expression of TLR4，MyD88，IκBa and NF-κB p65

1：Control組；2：Control+LPS組；3：HLJDD(5%)+LPS組；4：HLJDD(10%)+LPS組；5：HLJDD(20%)+LPS組；與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖2 各組BV2小膠質(zhì)細胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達變化Fig.2 Changes of TLR4，MyD88，p-IκBa，IκBa，p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expression in BV2 microglia in each group

2.3 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞IL-1β和IL-6分泌的影響

ELISA檢測結果顯示(圖3)：與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細胞上清液中IL-1β和IL-6的濃度均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而不同濃度黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)預處理后，BV2小膠質(zhì)細胞上清液中IL-1β和IL-6的濃度顯著下降，與Control+LPS組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖3 各組BV2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6含量Fig.3 Changes of IL-1β and IL-6 in BV2 microglia in each group

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應是AD等神經(jīng)退行性疾病的重要特征[12]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫防御細胞，β-淀粉樣蛋白沉積激活小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥反應是AD的核心病理機制[13-15]。既往研究表明，AD患者及實驗動物模型中均可觀察到β-淀粉樣蛋白周圍聚集有處于激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞[16-17]，小膠質(zhì)細胞分泌釋放多種炎性因子，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷[18-19]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，小膠質(zhì)細胞被激活后主要分化為發(fā)揮促炎作用的M1型和起抗炎作用的M2型[20-22]，因此，調(diào)控小膠質(zhì)細胞的激活是AD預防及治療的主要研究靶點之一。

黃連解毒湯是清熱解毒法的代表方劑，葛洪《肘后備急方》首次記載了其藥物組成，后經(jīng)唐朝王燾在《外臺秘要》中冠名為黃連解毒湯。本方由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥按3∶2∶2∶3的比例配伍組成。方中以黃連為君，瀉中焦之火，清心經(jīng)之熱；黃芩為臣，瀉上焦之火，清肺熱；黃柏為佐，瀉下焦之火，清腎經(jīng)虛熱；梔子為使，通瀉三焦之火，導火下行；四藥合用，苦寒直折，使火邪去而熱毒解，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證[23]。我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃連解毒湯可改善老年性癡呆(心肝火旺型)患者的智力和生活能力，延緩臨床癥狀的進展；同時既往研究證實黃連解毒湯相關中藥的活性成分具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[24-25]，但目前其調(diào)控神經(jīng)炎癥反應的機制尚未闡明。

本課題組前期通過LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞建立體外神經(jīng)炎癥模型[26]發(fā)現(xiàn)，BV2小膠質(zhì)細胞過度活化可激活TLR4信號通路，促進IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌；TLR4信號通路主要通過其銜接蛋白MyD88/NF-κB和TRIF途徑下傳信號，其中MyD88/NF-κB途徑是經(jīng)典信號傳導途徑。LPS等刺激后，經(jīng)過細胞內(nèi)復雜的信號轉(zhuǎn)導途徑，激活MyD88，可誘發(fā)細胞質(zhì)中無活性狀態(tài)NF-κB相關蛋白的磷酸化，促使NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活相應的靶基因，誘導多種促炎因子的表達，形成正反饋放大炎癥反應。故本實驗采用LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞活化建立體外神經(jīng)炎癥模型，運用此模型探討黃連解毒湯含藥血清對神經(jīng)炎癥反應的保護機制，實驗結果顯示LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞過量表達TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA，而黃連解毒湯含藥血清能有效抑制上述信號分子mRNA的表達；同時LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞過度活化可增高TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達，減少NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達，而黃連解毒湯含藥血清預處理后可抑制TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達，增加NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達；此外BV2小膠質(zhì)細胞在LPS誘導下分泌釋放炎癥因子IL-1β和IL-6的水平顯著增加，而黃連解毒湯含藥血清預處理后上述炎癥因子的分泌明顯減少。

綜上所述，LPS誘導BV2小膠質(zhì)細胞過度活化可誘發(fā)IκBa和NF-κB p65蛋白磷酸化，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，促進IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌；而黃連解毒湯含藥血清可抑制TLR4及MyD88的表達，影響IκBa降解和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位而發(fā)揮抗炎保護作用，即黃連解毒湯含藥血清可能通過TLR4/NF-κB信號通路來進行調(diào)控，初步闡明了黃連解毒湯的抗炎保護作用機制，為中醫(yī)清熱解毒法預防及治療AD等神經(jīng)炎癥相關性疾病提供了理論依據(jù)。由于時間和經(jīng)費的限制，本實驗僅運用體外實驗探討了黃連解毒湯的抗炎保護作用機制，并未運用體內(nèi)實驗去觀察黃連解毒湯對AD動物行為學及病理改變的影響，這將是我們今后進一步研究的方向之一。