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紅豆杉提取物維康醇對膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制的實驗研究

2021-01-04 02:37劉宏偉左玲柳建軍許志堅桂志明
關(guān)鍵詞:增殖紅豆杉膀胱癌

劉宏偉 左玲 柳建軍 許志堅 桂志明

【摘 要】 目的:探討紅豆杉提取物維康醇抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖的機(jī)制。方法:用維康醇處理膀胱癌T24細(xì)胞,MTS法檢測維康醇對細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測維康醇對細(xì)胞周期的影響;實時熒光定量PCR和westernblot檢測Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果:維康醇呈濃度和時間依賴性抑制T24細(xì)胞的增殖;維康醇誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期,并下調(diào)Cyclin D1、CDK4表達(dá),上調(diào)p21表達(dá)。結(jié)論:維康醇能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,可能與下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達(dá),上調(diào)p21表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期于G1期阻滯有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 紅豆杉;維康醇;膀胱癌;增殖;Cyclin D1

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517(2021)21-0015-04

Inhibitory Effect of Alteronol, an Extract from Taxus Chinensis, on the Proliferation of Bladder Cancer T24 cells

LIU Hongwei1 ZUO Ling2 LIU Jianjun1 XU Zhijian1 GUI Zhiming1

1.Department of Urology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, China;

2.Department of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524003,China

Abstract:Objective To investigate the mechanism of the inhibitory effect of Alteronol on the proliferation of bladder cancer T24 cells.Methods Bladder cancer T24 cells were treated with Alteronol. MTS assay was performed to test the effect of Alteronol on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect the effect of Alteronol on cell cycle, and real-time quantitative PCR and western blot were performed to detect the expression of cyclin D1, CDK4 and p21.Results Alteronol inhibited the proliferation of T24 cells in a concentration and time-dependent manner. Alteronol induced cell arrest in G1 phase, down-regulated the expression of cyclin D1 and CDK4, and up-regulated the expression of p21.Conclusion Alteronol can inhibit the proliferation of bladder cancer T24 cells, which may be related to the down-regulation of the expression of Cyclin D1 and CDK4 and up-regulation of p21 expression, leading to cell cycle arrest in G1 phase.

Keywords:Taxus Chinensis; Alteronol;Bladder Cancer;Proliferation; Cyclin D1

紅豆杉又名紫杉、赤柏松。辛、甘,大溫,歸胃、肝經(jīng)。紅豆杉的根、莖、葉都可以入藥,具有利尿消腫、通經(jīng)止痛的作用?!侗静菥V目》記載紅豆杉具有治療傷寒、霍亂、排毒等功效。紅豆杉是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌中藥,具有解毒散結(jié)之療效,在1992年被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期肺癌、卵巢癌、子宮癌等[1]。藥理研究[2]表明紅豆杉具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制血管生成、影響癌細(xì)胞代謝周期、逆轉(zhuǎn)腫瘤多耐藥性等抗癌藥理作用,其提取物紫杉醇對晚期乳腺癌、卵巢癌、消化道腫瘤、非小細(xì)胞肺癌等有明顯療效,總有效率高達(dá)75%以上,對膀胱癌也有較好的療效[3-5]。維康醇(Alteronol)是從云南紅豆杉樹皮中分離提取出微生物菌誘變株,對其菌絲體進(jìn)行特殊發(fā)酵、純化而獲取的一種新型單體化合物,其分子式為C20H14O6,分子量為350.3,是維泰醇(Alternol,C20H16O6,分子量為352.3)的同型異構(gòu)體[6],與臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇的來源相同[7]。

研究[6,8]表明維泰醇類化合物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,但對維康醇的研究不多。維康醇不僅可以抑制白血病HL-60細(xì)胞[9]、肝癌細(xì)胞[10]的增殖,而且可以誘導(dǎo)肺癌及前列腺癌細(xì)胞的凋亡[11-12]。目前維康醇對膀胱癌細(xì)胞的作用未明,本研究擬探討維康醇對膀胱癌細(xì)胞增殖、周期的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人膀胱癌T24細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 維康醇(汕頭市雙駿生物科技有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;青霉素/鏈霉素、MTS、Propidium Iodide、RNase A購自Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購自BINDER公司;SPARK 10 M酶標(biāo)儀(TECAN公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);QuantstudioTM DX system實時熒光定量 PCR儀(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液將T24細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每1~2天換液,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗研究。

1.2.2 MTS法檢測維康醇對T24細(xì)胞增殖的影響將T24細(xì)胞鋪于24孔板,24 h后分別用不同濃度的維康醇(4、8、12、16 μmol/L)進(jìn)行處理,對照組用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基替代,48 h后收集上述五組細(xì)胞,重懸細(xì)胞并計數(shù),以1×103個/孔接種于 96 孔板中,每個孔 200 μL,放在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,然后向每個孔加入 20 μL MTS 溶液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h,選取 492 nm 波長,在酶標(biāo)儀上測定OD值,重復(fù)三次,計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(Atreat-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集經(jīng)維康醇處理24 h后的T24細(xì)胞于離心管中,離心去培養(yǎng)液,加入3 mL預(yù)冷的70%乙醇,用槍頭吹打使細(xì)胞分散,置于4 ℃冰箱過夜,然后離心去乙醇,用PBS洗滌2次,加入0.05 mg/mL的Propidium Iodide和0.5 mg/mL的RNase A,避光下染色30min,上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期比例。

1.2.4 實施熒光定量PCR 收集經(jīng)維康醇不同處理組的T24細(xì)胞,RNAiso提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。將cDNA稀釋10倍,按10uL反應(yīng)體系采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物如下:CyclinD1-F:GCATGTTCGTGGCCTCTAAG,[JP4]CyclinD1-R:CGTGTTTGCGGATGATCTGT;CDK4-F: [JP]AGTGTGAGAGTCCCCAATGG;

CDK4-R: CCTTGATCTCCCGGTCAGTT;p21-F: TGCCCAAGCTC TACCTTC C,p21-R: CAGGTCCACATGGTCTTCCT;GAPDH-F:GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT;GAPDH-R:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反應(yīng)條件:95? ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸40 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt統(tǒng)計分析。

1.2.5 Western blot 用12 μmol/L的維康醇孵育T24細(xì)胞,48 h后棄培養(yǎng)基,PBS清洗一次,加入RIPA裂解液,收集對照組和處理組蛋白,BCA法測定蛋白濃度,按比例加入loadingbuffer,98 ℃ 5min進(jìn)行蛋白變性。每孔加入30 μg蛋白進(jìn)行電泳,濃縮膠設(shè)置80 V,分離膠設(shè)定100 V,電泳90min。然后采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,250 mA,2h。5%脫脂奶粉封閉1 h,分別孵育Cyclin D1、CDK4、p21兔多克隆抗體(1∶1000,proteintech公司)及GAPDH鼠單克隆抗體(1∶10000,ABclonal公司),4 ℃過夜。TBST洗膜,室溫下孵育二抗1 h,洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液曝光拍照。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件包,計量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,均通過正態(tài)性檢驗,組間計量資料比較采用本t檢驗,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維康醇呈濃度依賴性抑制膀胱癌細(xì)胞增殖 以不同濃度的維康醇(4、8、12、16 μmol/L)處理膀胱癌T24細(xì)胞48 h,細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加,分別為9.33%、16.26%、50.56%和61.03%。不同濃度維康醇組OD值與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 維康醇呈時間依賴性抑制膀胱癌細(xì)胞增殖 以12 μmol/L的維康醇作用于膀胱癌T24細(xì)胞,分別作用24、48、72、96 h,MTS結(jié)果顯示隨著時間的延長,維康醇對T24細(xì)胞的抑制率逐漸增加,維康醇處理96 h后,細(xì)胞的抑制率達(dá)74.30%,說明維康醇抑制T24細(xì)胞增殖存在時間依賴性。見表2。

2.3 維康醇對膀胱癌細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白的影響 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期結(jié)果顯示,當(dāng)以12 μmol/L的維康醇處理T24細(xì)胞24 h后,G1期比例由38.77%升至52.01%,S期比例由47.30%降至38.11%,G2期比例稍有下降(圖1A),進(jìn)一步對周期相關(guān)蛋白基因進(jìn)行qRT-PCR和western blot檢測,結(jié)果顯示,與對照組相比,維康醇作用的T24細(xì)胞中CDK4和Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著降低,p21的mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)(圖1B、1C)。

3 討論

維康醇是從云南昆明紅豆杉樹皮中提取、合成的一種新型單體化合物。研究[13]表明,維康醇可通過引起細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮其抗癌作用。如維康醇可能通過線粒體調(diào)控的內(nèi)源通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡[11],通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的底物磷酸化的Rb蛋白表達(dá)抑制白血病HL-60的增殖[9]。維康醇還可以抑制Akt/mTOR和TGFβ/Smad3通路,與自噬抑制劑3-MA聯(lián)合應(yīng)用不僅能顯著抑制黑色素瘤的生長,而且能抑制腫瘤的侵襲和遷移[14]。維康醇和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制乳腺癌4T1細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDC2和Cyclin B1的表達(dá)水平[15],誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,從而抑制細(xì)胞增殖[16]。維康醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞死亡的方式主要為時間依賴性的晚期凋亡,其效果優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物伊立替康(CPT-11)、多西他賽及紫杉醇[12]。本研究采用不同濃度的維康醇干預(yù)膀胱癌T24細(xì)胞,結(jié)果表明維康醇顯著抑制細(xì)胞增殖,存在時間和劑量依賴性,說明維康醇亦對膀胱癌發(fā)揮一定的抗癌作用。

G1/S期和G2/M期是細(xì)胞周期的兩個關(guān)鍵限制點,其中G1/S期在啟動細(xì)胞周期過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了探討維康醇抑制膀胱癌增殖的作用機(jī)制,進(jìn)一步檢測了其對細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示維康醇處理后T24細(xì)胞的G1期比例明顯增加,S期比例明顯下降,與既往研究結(jié)果一致。劉亮亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)以1.6 μg/mL維康醇孵育白血病HL-60細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的G1期比例由34.9%增加至53.0%,S期比例由54.4%減少至32.9%。在G1/S限制點,CyclinD1、CyclinE分別與CDK4、CDK2形成激酶復(fù)合物,促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、惡變。HeLa細(xì)胞經(jīng)維康醇處理后,Cyclin D1和CDK4蛋白水平顯著下降[17]。本研究同樣表明,維康醇處理膀胱癌細(xì)胞24 h后 Cyclin D1和CDK4表達(dá)明顯下調(diào),p21表達(dá)上調(diào),說明維康醇可能通過下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達(dá),上調(diào)p21表達(dá),使T24細(xì)胞在G1期受阻,進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物研發(fā)的作用機(jī)制之一,目前研究報道大多數(shù)腫瘤細(xì)胞經(jīng)維康醇處理后出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象,如30 μmol/L維康醇作用于HepG2細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率顯著升高[10]。唐宇哲等通過維康醇孵育前列腺癌PC3細(xì)胞12 h,PC3晚期細(xì)胞凋亡率達(dá)14.8%±1.2%,明顯高于正常前列腺細(xì)胞株BPH1的6.8%±1.1% [12],但經(jīng)維康醇處理的前列腺癌細(xì)胞株DU145和白血病HL-60的凋亡比例較低,均低于10%[9, 12]。維康醇是否也誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,維康醇能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,其可能與下調(diào)Cyclin D1和CDK4表達(dá),上調(diào)p21表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞G1期阻滯有關(guān),但其深入機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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(收稿日期:2021-03-12 編輯:劉斌)

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