朱亞清, 李春輝*, 何 濤, 劉寧寧
(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科, 河北 承德 067000 2.河北省承德市中心醫(yī)院, 河北 承德 067000)
胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。我國(guó)每年胃癌的新發(fā)病例可達(dá)世界新發(fā)病例的40%以上[2]。臨床多數(shù)患者就診時(shí)已屬進(jìn)展期乃至晚期,手術(shù)無(wú)法根治,隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,靶向治療和聯(lián)合靶向治療已成為提高腫瘤患者生存率的一個(gè)受關(guān)注的研究方向[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ANP對(duì)肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)的作用[4]。在胃組織上也存在A(yíng)NP受體。迄今關(guān)于A(yíng)NP對(duì)胃癌細(xì)胞的影響以及其潛在分子機(jī)制尚未有詳細(xì)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)擬探討ANP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的體外作用和聯(lián)合PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的體外作用及其可能機(jī)制。
1.1材料:低分化人類(lèi)胃癌細(xì)胞株MGC-803由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所饋贈(zèng);RPMI1640培養(yǎng)基(Corning);胎牛血清(Cegrogen);PBS(BI);胰蛋白酶(Gibco);ANP(Aladdin);LY294002(Cayman);CCK-8(美侖);兔抗人Akt1/2/3 (Huananbio);兔抗人P-Akt(ser473)(Affinity Biosciences);兔抗人β-actin一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司;廣譜marker、BCA試劑盒、RIPA(附PMSF)、Westen Blot膜再生液均購(gòu)自Solarbio;超敏ECL液(大連美侖);SDS-PAGED蛋白上樣緩沖液(貝博)等。
1.2方 法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):人胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),1~2d換液一次,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%及以上時(shí),1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2溶液的配置:LY294002溶液的配置325μL DMSO溶液充分溶解5mg LY294002干粉,配成50mmoL/L的LY294002溶液,分裝,-20℃保存,使用前用培養(yǎng)基稀釋成特定的濃度。ANP溶液的配置 1623μL無(wú)菌超純水充分溶解500μg的ANP干粉,配成10~4moL/L的ANP溶液,分裝,-20℃保存,使用前用培養(yǎng)基稀釋成特定的濃度。
1.2.3CCK-8法:檢測(cè)ANP對(duì)細(xì)胞增殖的影響:張佳[5]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較高濃度ANP(10-6、10-7moL/L)對(duì)胃癌細(xì)胞AGC增殖有抑制作用,故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同濃度的ANP組(10-5、10-6、10-7moL/L)1.2.1傳代細(xì)胞以4×104/mL的密度均勻接種于96孔板中,每孔100μL,培養(yǎng)24h,棄去舊的培養(yǎng)基,向96孔板中加入ANP儲(chǔ)備液處理MGC-803細(xì)胞,使終濃度分別為10-5、10-6、10-7moL/L,每個(gè)濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)選定6個(gè)孔設(shè)為對(duì)照組(含細(xì)胞和培養(yǎng)基),另設(shè)6個(gè)空白孔(只含培養(yǎng)基,扣除培養(yǎng)基本身的OD值)。分別在培養(yǎng)12、24和48h后,用CCK-8試劑盒,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次,統(tǒng)計(jì)結(jié)果。檢測(cè)LY294002對(duì)細(xì)胞的增殖的影響:設(shè)置對(duì)照組(只含細(xì)胞和培養(yǎng)基)和不同濃度的LY294002組(10、20、30、40、50μmoL/L)。種板方法同上,培養(yǎng)24h后,按照分組換上完全培養(yǎng)基和不同濃度的LY294002完全培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)24h、48h和72h后,用CCK-8試劑盒,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次,統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
分別計(jì)算ANP、LY294002對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。
依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果選細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在30%~50%的10-5moL/L ANP,30μmoL/L LY294002行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。方法同上,檢測(cè)各組作用48h后各孔的吸光度(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,求得各組平均細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
1.2.4觀(guān)察MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu):設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細(xì)胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中,2mL/孔,培養(yǎng)24h,棄舊培養(yǎng)基,根據(jù)分組分別加入完全培養(yǎng)基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的完全培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48h后,觀(guān)察各組MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化并拍照。
1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):在6孔板背后每隔0.5~1cm橫穿過(guò)孔劃5條平行線(xiàn)。設(shè)置對(duì)照組、10-5moL/L ANP組、30μmoL/L LY294002組、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002組。1.2.1傳代細(xì)胞以1×105/ mL的密度均勻接種于6孔板中,2mL/孔,培養(yǎng)24h,細(xì)胞單層貼壁90%以上匯合度,移液槍頭垂直于孔板背后的橫線(xiàn)做劃痕,PBS洗滌3次,洗去劃下的細(xì)胞,根據(jù)分組加入無(wú)血清培養(yǎng)基、含10-5moL/L ANP、30μmoL/L LY294002、10-5moL/L ANP+30μmoL/L LY294002的無(wú)血清培養(yǎng)基,2mL/孔。分別在培養(yǎng)0、24h取樣,拍照,記錄細(xì)胞遷移情況,Image J分析計(jì)算劃痕面積。計(jì)算各組劃痕面積修復(fù)率(%)=[劃痕創(chuàng)傷面積(0h)-劃痕創(chuàng)傷面積(24h)]/劃痕創(chuàng)傷面積(0h)×100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,計(jì)算平均值。
1.2.6Western Blotting:同1.2.4細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)48h后,將6孔板置于冰上,PBS洗滌3次,吸凈PBS,100μL/孔裂解液,冰上裂解60min,將細(xì)胞全部刮下轉(zhuǎn)移至EP管中,4℃,12000 r/min,15min取出EP管,移取上清至新的EP管中,并作好標(biāo)記,行BCA蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,TBST洗滌1次,5%脫脂奶粉常溫封閉2h,TBST洗滌2次,一抗4℃孵育過(guò)夜(t-Akt、P-Akt、β-actin工作濃度分別為1∶1000、1∶1000、1∶3000),TBST洗滌3次,二抗搖床上孵育2h,TBST洗滌3次,ECL試劑顯影,凝膠成像儀拍照,Image J軟件進(jìn)行灰度分析。不同批次蛋白重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
表1 各組大鼠免疫組化結(jié)果(OD值)
2.1CCK8結(jié)果ANP,LY294002及ANP聯(lián)合LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的影響:ANP和LY294002對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖均有抑制作用,且呈時(shí)間-劑量依賴(lài)性,見(jiàn)表1,2。與ANP組和LY294002組相比,ANP聯(lián)合LY294002應(yīng)用對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng),見(jiàn)表3。
表2 不同濃度的LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響
表3 ANP聯(lián)合LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響
2.2MGC-803細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化:顯微鏡下發(fā)現(xiàn),對(duì)照組MGC-803細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好;與對(duì)照組比較,ANP組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目減少,狀態(tài)稍差;LY294002組細(xì)胞與對(duì)照組比較,生長(zhǎng)嚴(yán)重受限,表現(xiàn)為部分細(xì)胞回縮甚至破裂懸浮狀態(tài);(ANP+LY294002)組與二者單獨(dú)應(yīng)用組比較MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)受限更顯著,細(xì)胞碎裂并出現(xiàn)異常細(xì)胞形態(tài)。見(jiàn)圖1。
圖1 MGC-803細(xì)胞形態(tài)的改變(×200)
2.3劃痕結(jié)果:與對(duì)照組比較,ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細(xì)胞劃痕愈合速度減慢,且ANP+LY294002組劃痕愈合速度最慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3,圖2。
表3 ANP和LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響
圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力變化
2.4對(duì)MGC-803細(xì)胞中t-Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較,ANP組、LY294002組及ANP+LY294002組細(xì)胞p-Akt表達(dá)明顯降低,且ANP+LY294002組細(xì)胞p-Akt表達(dá)降低最顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四組間細(xì)胞t-AKT蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4、圖3。
表4 細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量
圖3 免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
胃癌的發(fā)生與細(xì)胞的異常分化、增殖及遷移等密切相關(guān),所以在胃癌的治療過(guò)程中抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移很重要。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ANP可抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖,并和濃度和作用時(shí)間相關(guān)。劃痕實(shí)驗(yàn),10-5moL/L ANP作用于MGC-803細(xì)胞與對(duì)照組比較,劃痕的愈合速度變慢,這就揭示ANP可抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移,從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲力。本文研究結(jié)果表明ANP可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。ANP主要由心房肌細(xì)胞產(chǎn)生的多功能內(nèi)源性活性多肽,在心血管系統(tǒng)ANP可增加血管通透性,舒張血管平滑肌,調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡等作用[6]。高于生理劑量的ANP可抑制肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng),并且對(duì)正常細(xì)胞卻沒(méi)有明顯的毒副作用[4]。這使得ANP可成為一種很有開(kāi)發(fā)前景的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑。
腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)M織及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,目前研究表明與多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活狀態(tài)有關(guān)[7]。Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路上最關(guān)鍵的信號(hào)分子,因此被用于多種腫瘤的研究中[8]。本實(shí)驗(yàn)CCK8實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002抑制可以抑制MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移。在Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示單用LY294002下調(diào)了人胃癌細(xì)胞株MGC-803中p-Akt的表達(dá)量,而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化。單用ANP同樣下調(diào)了人胃癌細(xì)胞株MGC-803中p-Akt的表達(dá)量,而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化,所以ANP抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖和遷移的機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。
聯(lián)合靶向治療在某些腫瘤的臨床治療中可進(jìn)一步改善臨床療效。在本實(shí)驗(yàn)中ANP聯(lián)合LY294002對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用比二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更為顯著。ANP聯(lián)合LY294002對(duì)MGC-803細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)量降低比二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)也更為顯著,而t-AKT表達(dá)無(wú)明顯變化,提示ANP和LY294002聯(lián)合應(yīng)用共同對(duì)抑制PI3K/AKt通路發(fā)揮了增強(qiáng)作用。
綜上所述,ANP可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖和遷移,ANP和LY294002聯(lián)合應(yīng)用共同對(duì)抑制PI3K/AKt通路發(fā)揮了增效作用,為聯(lián)合靶點(diǎn)抑制治療胃癌提供了新的思路。不足的是本實(shí)驗(yàn)從單一細(xì)胞系進(jìn)行研究,并且未作動(dòng)物體內(nèi)的整體實(shí)驗(yàn),另外ANP對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用以及ANP聯(lián)合LY294002作用增強(qiáng)的原因,可能也與其他信號(hào)通路之間存在著交互作用,有待于進(jìn)一步研究。