郝玉冰 張安玲 王虎 王廣秀 高照 賈志凡

腦膠質(zhì)瘤是一種由多基因、多因素誘發(fā)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，在遺傳學(xué)、組織學(xué)和臨床特征方面存在異質(zhì)性。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤中最為常見的類型，具有較強(qiáng)的侵襲性和增殖能力，患者預(yù)后差、病死率高［1?3］。膠質(zhì)瘤的侵襲特性和某些基因如O6?甲基鳥嘌呤?DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）引起的耐藥性使現(xiàn)有治療方法難以達(dá)到臨床治愈效果［4］，因此從基因水平尋找新的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。蛋白激酶N1（PKN1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT），與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)［5?7］，PKN1 基 因 可 在 雄 激 素 的 參 與 下 調(diào) 節(jié) 前 列腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞集落形成［7?8］，并參與宮頸癌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架形成和腫瘤細(xì)胞增殖［9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，PKN1 蛋白廣泛表達(dá)于大鼠腦組織，對(duì)多巴胺能、5?羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元的生物學(xué)行為有一定影響［10］，同時(shí)，PKN1 基因還在小腦平行纖維形成、軸突生長(zhǎng)與突觸分化平衡的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［11］。然而，目前關(guān)于PKN1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的作用較少受到關(guān)注，本研究采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫檢索PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，通過干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172 細(xì)胞株P(guān)KN1 基因表達(dá)觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，以期為膠質(zhì)瘤基因治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. PKN1 基因數(shù)據(jù)來源 登錄GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）檢索PKN1 基 因，獲 得PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)分布圖并可直接使用，在“Expression DIY”功能區(qū)選擇“Boxplot”，自動(dòng)生成正常腦組織和膠質(zhì)瘤PKN1 基因表達(dá)箱式圖。

2.細(xì)胞系來源 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229、U87 和A172 細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所神經(jīng)腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供；PKN1 小干擾RNA（siRNA）載體為腺病毒，購于中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和腺病毒均置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 試劑與儀器 （1）主要試劑：RIPA 工作液［RIPA 與苯甲基磺酰氟（PMSF）體積比為100 ∶1］和Western blotting 檢測(cè)試劑盒購自上海索萊寶生物技術(shù)公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）由美國(guó)Gibco 公司提供；細(xì)胞培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus 公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染劑Entranster?R4000 購自中國(guó)Engreen 公司。PKN1 siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)公司提供，包 括 無 意 義 siRNA （siRNA ? NC： 5’ ?UUCUCCGAACGUGUCACGUTT?3’）和siRNA?PKN1（5’?AAGGGCACGGGAACTGGAGTT?3’）。Ⅰ抗工作液（PKN1 與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂牛奶體積之比為1 ∶1000）和Ⅱ抗 工 作 液［甘 油 醛?3?磷 酸 脫 氫 酶（GAPDH）與磷酸鹽緩沖液（PBS）的體積之比為1 ∶10 000］為美國(guó)Santa Cruz 公司產(chǎn)品；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液購自美國(guó)Millipore 公司；CCK?8 檢測(cè)試劑盒為日本同仁公司產(chǎn)品；Annexin V?異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒由上海愛必信生物科技公司提供；胰酶細(xì)胞消化液、焦碳酸二乙酯處理（DEPC）管、DEPC 水和Transwell 小室均為美國(guó)Corning 公司產(chǎn)品；Matrigel 基質(zhì)膠購自美國(guó)BD公司。（2）主要儀器：L500 型小型離心機(jī)由中國(guó)湘儀公司提供；5417R 型4 ℃高速離心機(jī)為中國(guó)香港基因有限公司產(chǎn)品；6Box iChemi XT 凝膠成像系統(tǒng)購自美國(guó)Syngene 公司；IX81 型光學(xué)倒置相差顯微鏡由日本Olympus 公司提供；PowerPac 電泳儀由美國(guó)Bio?Rad 公 司 生 產(chǎn)；SN258642 型 酶 標(biāo) 儀 購 自 美 國(guó)BioTek 公司。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229、U87 和A172 置37 ℃水浴鍋復(fù)蘇5 min，離心半徑10 cm、800 r/min 離心5 min，去上層凍存液；加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基充分混勻，轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿搖勻，置37 ℃、含5%二氧化碳（CO2）恒溫箱培養(yǎng)，隔夜更換培養(yǎng)基。細(xì)胞達(dá)75%~90%融合時(shí)消化處理傳代，傳至第3 代時(shí)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2. 干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172 細(xì)胞PKN1 基因表達(dá)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前24 h 將膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172 細(xì)胞鋪種于6 孔板，細(xì)胞數(shù)為200×103個(gè)/孔，細(xì)胞融合達(dá)60%~70%時(shí)轉(zhuǎn)染攜帶siRNA 序列腺病毒，于首次轉(zhuǎn)染驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中加入空白對(duì)照組，以排除腺病毒對(duì)A172 細(xì)胞的影響。敲低實(shí)驗(yàn)分為siRNA?NC 組（對(duì)照組）和siRNA?PKN1 組（實(shí)驗(yàn)組），兩組各有2 支200 μl DEPC 管，每管均加入無血清DMEM 培 養(yǎng) 液50 μ l，其 中 一 管 滴 加 轉(zhuǎn) 染 劑Entranster?R4000 5 μl，另一管則滴加siRNA 工作液（1 OD 的siRNA 粉末以125 μl DEPC 水溶解）5 μl，于室溫靜置5 min，每組兩管充分混勻，于室溫靜置15 min，更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，然后分別加入轉(zhuǎn)染工作液，搖勻，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，6~8 h 后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h備用。

3. Western blotting 法檢測(cè)PKN1 蛋白表達(dá)變化 分別檢測(cè)LN229、U87、A172 膠質(zhì)瘤細(xì)胞和敲低PKN1 基因后A172 細(xì)胞PKN1 蛋白表達(dá)量。腫瘤細(xì)胞去除培養(yǎng)基后以4 ℃預(yù)冷PBS 1 ml 洗滌2 次，滴加RIPA 工作液（RIPA 與PMSF 體積之比為100 ∶1）150~200 μl/孔，并充分鋪勻培養(yǎng)皿底部，置于冰上裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，于4 ℃、離心半徑為10 cm、2000 r/min 離心10 min，取上清蛋白質(zhì)原液，酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白質(zhì)原液光密度（OD）值并計(jì)算總蛋白含量（總蛋白含量=1.494×OD-0.283），滴加適量4×蛋白上樣緩沖液（緩沖液與蛋白原液體積比為1 ∶3），水浴 煮沸5 min，分裝于1.50 ml EP 管中（150 μl/管），置?80 ℃保存?zhèn)溆?。將備用?xì)胞蛋白液行SDS?PAGE，蛋白質(zhì)移至PVDF 膜，37 ℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂牛奶封閉1 h，根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量剪膜，滴加Ⅰ抗工作液（PKN1 與5%脫脂牛奶體積之比為1 ∶1000），4 ℃過夜，恢復(fù)至室溫，滴加Ⅱ抗工作液（GAPDH 與PBS 體積比為1 ∶10 000），室溫下?lián)u床慢搖1 h，滴加1 ml 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液，于曝光儀上檢測(cè)目的蛋白印跡，Image J 軟件測(cè)定電泳條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參照物，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4.敲低PKN1 基因表達(dá)觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為變化 通過干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞株P(guān)KN1 基因表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。（1）CCK?8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A172 細(xì)胞接種于6 孔板并使細(xì)胞數(shù)達(dá)200×103個(gè)/孔，隔夜，確保每孔細(xì)胞融合達(dá)60%~75%再行siRNA 轉(zhuǎn)染，置于37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細(xì)胞接種于96 孔板，細(xì)胞數(shù)為2×103個(gè)/孔，待細(xì)胞完全貼壁后行CCK?8 實(shí)驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞去培養(yǎng)基，滴加100 μl 無血清DMEM 培養(yǎng)液，再滴加10 μl CCK?8 試劑，置37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀上于450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD 值，連續(xù)檢測(cè)6 d。（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化：采用胰酶細(xì)胞消化液消化處理siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細(xì) 胞，Binding Buffer 試 劑（凋亡檢測(cè)試劑盒）使細(xì)胞重懸于1.50 ml EP 管，細(xì)胞數(shù)為50×103個(gè)/管，滴加Annexin V?FITC 5 μl/管，室溫靜置10 min，滴加5 μl PI，室溫靜置5 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡程度，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率（右上象限和右下象限細(xì)胞所占比例）。（3）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞數(shù)為250×103個(gè)/孔，37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞融合達(dá)75%~80%；再以200 μl 無菌槍頭尖部在6 孔板中劃“十”字，去培養(yǎng)基，加入無血清DMEM 培養(yǎng)液，以首次劃痕拍照計(jì)為0 h，此后每12 小時(shí)拍照1 次，記錄劃痕面積并計(jì)算劃痕愈合率［劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕面積-測(cè)量時(shí)劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%］，后者即為腫瘤細(xì)胞遷移能力。（4）Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將Transwell 小室置于24 孔板，小室中鋪Matrigel 基質(zhì)膠60 μl，使無血清DMEM 培養(yǎng)基與Matrigel 基質(zhì)膠體積之比達(dá)3 ∶1，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，待Matrigel 基質(zhì)膠凝集，上室滴加無血清DMEM 培養(yǎng)基200 μl，其中包含轉(zhuǎn)染的A172細(xì)胞（siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組細(xì)胞數(shù)各30×103個(gè)），下室滴加含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室，蒸餾水清洗，以體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液固定20 min，蒸餾水清洗，以體積分?jǐn)?shù)為0.4%結(jié)晶紫染色20 min，于光學(xué)顯微鏡（×100）下選擇任意4 個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)目，取平均值，即為腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

5.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用GraphPad PRISM 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，兩兩比較行LSD?t 檢驗(yàn)；siRNA?NC 組與siRNA?PKN1 組A172 細(xì) 胞不同觀察時(shí)間點(diǎn)劃痕愈合率的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較行LSD?t 檢驗(yàn)。以P ≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PKN1 mRNA 在多種腫瘤組織中的表達(dá)量均高于正常組織，其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PKN1 mRNA 表達(dá)量高于正常腦組織，詳見圖1。

Western blotting 法檢測(cè)顯示，不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，表1），其中A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于U87 細(xì)胞（t = 3.096，P = 0.036）和LN229 細(xì)胞（t=8.994，P=0.000），而U87 細(xì)胞與LN229 細(xì)胞之間PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =2.511，P = 0.066；圖2）。敲 低PKN1 基 因 表 達(dá) 后，A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組（t = 48.010，P = 0.000）和siRNA?NC 組（t = 43.770，P=0.000），而siRNA?NC 組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.888，P=0.425；圖3，表2）。

敲低PKN1 表 達(dá)第1 和2 天，siRNA?PKN1 組 與siRNA?NC 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；第3~6 天，siRNA?PKN1 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力低于siRNA?NC 組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031，0.004，0.000，0.003；表3）。

敲低PKN1 基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，A172 細(xì)胞凋亡率為23.90% ~ 28.20%、平 均 為（26.66 ± 1.39）%，而siRNA?NC 組A172 細(xì)胞凋亡率為16.33%~19.01%、平均（17.90±0.81）%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.461，P=0.006；圖4）。

隨著時(shí)間推移，siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細(xì)胞劃痕愈合率逐漸增加（P=0.000），其中，12 h（P=0.001，0.000）和36 h（P=0.000，0.000）A172細(xì)胞劃痕愈合率高于0 h，36 h 劃痕愈合率亦高于12 h（P=0.001，0.017）；而敲低PKN1 基因表達(dá)后，A172 細(xì)胞劃痕愈合率低于siRNA?NC 組（P=0.000；圖5；表4~6）。

敲 低PKN1 基因 表 達(dá) 后，siRNA?PKN1 組A172細(xì)胞的穿膜數(shù)目為17 ~ 18 個(gè)、平均為（17.330 ±0.577）個(gè)，而siRNA?NC 組A172 細(xì)胞的穿膜數(shù)目為26~33 個(gè)、平均（29.330±3.512）個(gè)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.840，P=0.004；圖6）。

討 論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，其發(fā)生與發(fā)展由多基因、多因素所引起，并且腫瘤的侵襲性和相關(guān)基因誘發(fā)的耐藥性使治療愈發(fā)困難，患者生存率較低。PKN1 基因可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，例如可以通過PKN1?WDR5?KAT8 和PKN1?H3T11P?WDR5?H3K4me3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)前 列 腺 癌 細(xì) 胞 的 增 殖［7?8］，亦 可 以 與GTP 酶Rho 結(jié)合從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［12?13］。

GEPIA 數(shù)據(jù)庫涵蓋大量基因數(shù)據(jù)，可從中尋找到許多基因的差異體和相似體，也可檢索到某一基因在正常組織及其相應(yīng)腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量，以及該基因相對(duì)表達(dá)量與腫瘤級(jí)別的相關(guān)性，從而預(yù)測(cè)該基因與腫瘤之間的關(guān)系。通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)，PKN1 mRNA 在膠質(zhì)瘤、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于其所對(duì)應(yīng)的正常組織，提示PKN1 可能為膠質(zhì)瘤相關(guān)基因，但該基因在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中的作用目前尚不明確。

對(duì)多 個(gè) 膠 質(zhì) 瘤 細(xì) 胞系（U87、LN229 和A172）PKN1 蛋白表達(dá)量的分析顯示，以膠質(zhì)瘤A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量最高，因此，后續(xù)研究可采用RNA 干擾（RNAi）技術(shù)敲除A172 細(xì)胞PKN1 基 因，以觀察該基因?qū)172 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

細(xì)胞增殖能力可直接反映腫瘤細(xì)胞活力，本研究CCK?8 實(shí)驗(yàn)顯示，敲低PKN1 基因表達(dá)后第3 天，A172 細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，并可以持續(xù)至第6 天，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PKN1 基因表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡形式［14］，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制，可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，也可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥［15］。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，敲低PKN1 基因表達(dá)后，A172 細(xì)胞凋亡率增加，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PKN1 基因表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展。遷移和侵襲能力是腫瘤細(xì)胞的另一生物學(xué)特性，與腫瘤惡性程度和預(yù)后直接相關(guān)，本研究采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力，其結(jié)果顯示，siRNA?PKN1組和siRNA?NC 組A172 細(xì)胞劃痕愈合率隨時(shí)間推移具有不同程度增加，而敲低PKN1 基因表達(dá)后A172細(xì)胞劃痕愈合率降低且低于siRNA?NC 組，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PKN1 基因表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移；與此同時(shí)，Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，敲低PKN1 基因表達(dá)后，A172 細(xì)胞穿過Matrigel 基質(zhì)膠的數(shù)目明顯減少，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PKN1 基因表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫PKN1 mRNA 表達(dá)量 1a 多種腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的正常組織PKN1 基因表達(dá)譜 1b 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（163 例）PKN1 mRNA 表達(dá)量高于正常腦組織（207 例，P<0.05） 1c 所有腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的正常組織PKN1 基因表達(dá)譜（每點(diǎn)代表樣本表達(dá)量）Figure 1 Expression of PKN1 mRNA in the GEPIA database The PKN1 gene expression profile across some tumor samples and paired normal tissues (Panel 1a). The expression of PKN1 mRNA in glioblastoma (163 cases)was higher than that in normal brain tissue (207 cases, P < 0.05; Panel 1b). The PKN1 gene expression profile across some tumor samples and paired normal tissues (Each dot represents expression of samples, Panel 1c).

表1 不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 1. Relative expression of PKN1 in glioma cell lines (±s)

組別A172 細(xì)胞U87 細(xì)胞LN229 細(xì)胞F 值P 值例數(shù)3 3 3 PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量0.95±0.09 0.69±0.12 0.51±0.01 20.180 0.002

圖2 Western blotting 法檢測(cè)顯示，A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于U87 和LN229 細(xì)胞Figure 2 Western blotting showed the PKN1 protein expression in A172 cells was higher than that in U87 and LN229 cells.

圖3 Western blotting 法檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染siRNA?PKN1 后A172細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低Figure 3 Western blotting showed the expression of PKN1 in A172 cells after siRNA?PKN1 transfection was reduced.

表2 不同組別A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 2. Relative expression of PKN1 in blank group,siRNA?NC group and siRNA?PKN1 group (±s)

表2 不同組別A172 細(xì)胞PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 2. Relative expression of PKN1 in blank group,siRNA?NC group and siRNA?PKN1 group (±s)

siRNA，small interference RNA，小 干 擾RNA；PKN1，protein kinase N1，蛋白激酶N1。The same for Table 3 and 4

例數(shù)組別空白對(duì)照組siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組F 值P 值3 3 3 PKN1 蛋白相對(duì)表達(dá)量0.70±0.01 0.69±0.01 0.24±0.01 1351.000 0.000

表3 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組A172 細(xì)胞增殖能力的比較（±s，OD450 nm）Table 3. The proliferation ability of A172 cells between siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group (±s, OD450 nm)

表3 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組A172 細(xì)胞增殖能力的比較（±s，OD450 nm）Table 3. The proliferation ability of A172 cells between siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group (±s, OD450 nm)

組別siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組t 值P 值例數(shù)3 3第1 天0.38±0.01 0.37±0.01 0.889 0.424第2 天0.39±0.01 0.37±0.01 1.040 0.357第3 天0.63±0.03 0.51±0.02 3.275 0.031第4 天0.72±0.02 0.53±0.03 5.949 0.004第5 天0.81±0.03 0.48±0.01 10.430 0.000第6 天0.83±0.05 0.46±0.02 6.645 0.003

圖4 流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染siRNA?PKN1 后A172 細(xì)胞凋亡率增加 4a siRNA?NC 組 4b siRNA?PKN1 組Figure 4 Flow cytometry showed the cell apoptosis of A172 cells was increased after siRNA?PKN1 transfection. siRNA?NC group (Panel 4a). siRNA?PKN1 group (Panel 4b).

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA?PKN1 組A172 細(xì)胞劃痕的愈合能力明顯低于siRNA?NC 組 HE染色 ×100Figure 5 Scratch healing test showed the scratch healing ability of siRNA?PKN1 group was significantly weaker than that of siRNA?NC group. HE staining ×100

綜上所述，膠質(zhì)瘤PKN1 mRNA 表達(dá)量高于正常腦組織，敲低PKN1 基因表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展。本研究?jī)H對(duì)PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化，以及敲除PKN1 基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響進(jìn)行了初步探討，PKN1基因影響膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及對(duì)患者預(yù)后和生存影響尚待進(jìn)一步深入研究，以期為膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供新的靶標(biāo)。

表4 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時(shí)間點(diǎn)A172 細(xì)胞劃痕愈合率的比較（±s，%）Table 4. The scratch healing rate of A172 cells at different time points between siRNA ? PKN1 group and siRNA?NC group (±s, %)

表4 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時(shí)間點(diǎn)A172 細(xì)胞劃痕愈合率的比較（±s，%）Table 4. The scratch healing rate of A172 cells at different time points between siRNA ? PKN1 group and siRNA?NC group (±s, %)

組別siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組例數(shù)3 3 0 h（1）0.00±0.00 0.00±0.00 12 h（2）11.42±5.66 11.40±0.36 36 h（3）48.25±1.49 29.24±0.85

表5 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時(shí)間點(diǎn)A172 細(xì)胞劃痕愈合率重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析Table 5. Repeated measurement design analysis of variance of the scrath healing rate of siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group at different time points in A172 cells

表6 同一處理組不同觀察時(shí)間點(diǎn)A172 細(xì)胞劃痕愈合率的兩兩比較Table 6. Pairwise comparison of the scratch healing rate of A172 cells at the different time points in the same treatment group

圖6 光學(xué)顯微鏡觀察顯示，敲低PKN1 基因表達(dá)后A172 細(xì)胞穿膜數(shù)目減少 結(jié)晶紫染色 × 100 6a siRNA?NC 組 6b siRNA?PKN1 組Figure 6 Optical microscopy showed the number of A172 cells passing through the membrane decreased after PKN1 gene was knocked down Crystal violet staining ×100 siRNA?NC group (Panel 6a). siRNA?PKN1 group (Panel 6b).

利益沖突無