吳禮婷 伍清華 彭 芳 洪 瑋

1.廣州醫(yī)科大學第三臨床學院，廣東廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院ICU科，廣東廣州 511436；3.廣州醫(yī)科大學生命科學學院，廣東廣州 511436

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以小氣道呼氣受阻為主要特征的慢性進行性疾病，主要病理特征為慢性支氣管炎（氣道損傷、重塑）和肺氣腫（肺組織彈力纖維破壞）。COPD的發(fā)病機制與炎癥細胞密切相關，如巨噬細胞、中性粒細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CD8+T細胞）等。另外，還與蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡、氧化應激、自身免疫機制及細胞衰老等有關。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡使肺的組織結構細胞破壞程度遠遠大于其自身的正常生長，從而促進了COPD的發(fā)生發(fā)展[1-3]。凋亡學說對肺泡間隔的結構細胞和肺血管內皮細胞的影響，參與了肺氣腫的發(fā)病機制，其中尤以肺泡上皮細胞的凋亡致肺氣腫形成備受關注[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，嚴重的內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）能夠誘導肺上皮細胞的凋亡，這是目前COPD發(fā)病機制研究的重要內容[6]。ERS發(fā)生的關鍵因子葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），在有害刺激程度較輕時可以對肺組織結構細胞起到一定的保護作用，當有害刺激程度加重或持續(xù)時間較長時，GRP78對肺組織結構細胞的保護作用喪失，該因子下游的ERS致細胞凋亡的相關通路被激活，細胞凋亡程序啟動，最終引起內質網(wǎng)應激特異凋亡分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白-12（cysteinyl aspartatespecific proteinase-12，caspase-12）和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/C/EBP homologous protein，CHOP）表達增加，誘導細胞凋亡[7-9]。有研究表明，PI3K/Akt通路能夠通過對抑制生長阻滯和DNA損傷誘導蛋白153（growth arrest and DNA damage-inducible gene153，GADD153）的誘導，從而對ERS細胞起保護作用[10]。PI3K/Akt通路也可通過對ERS誘導GRP78表達增加發(fā)揮保護作用。研究表明，配體酪氨酸激酶受體系統(tǒng)是PI3K/Akt通路的激活劑[11]。Lyn激酶是非受體酪氨酸激酶Src家族成員，Lyn激酶在調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、代謝與免疫反應等過程中起著重要的作用。此外，Lyn激酶與多種信號途徑相關聯(lián)，在很多組織細胞中有正向或負向的調節(jié)作用[12-14]。有研究表明，在肺功能的危重癥COPD患者中均可檢測到Lyn基因的出現(xiàn)，但與Lyn激酶在COPD的發(fā)生發(fā)展中的機制相關的報道較少[15]。體內缺乏Lyn激酶的小鼠（Lyn -/-小鼠）表現(xiàn)出顯著升高的白細胞介素-17（interlukin-17，IL-17）和干擾素γ（interferon gama，IFN-γ）[16]。IL-17是記憶T細胞分泌的前炎癥因子，與多種炎癥反應和自身免疫反應相關，可以促進氣道阻塞的發(fā)生和誘導COPD急性加重，導致肺氣腫的發(fā)生和發(fā)展[17]。探討Lyn激酶對COPD發(fā)生過程中的作用及其機制，對于尋找COPD治療新靶點及新型藥物有重要意義。本文將探討Lyn激酶通過PI3K/Akt通路對內質網(wǎng)應激途徑對炎癥因子IL-17的調節(jié)在COPD發(fā)病機制中的作用。

1 內質網(wǎng)應激過度引起細胞凋亡的發(fā)生

細胞結構與功能的正常維持與很多機體環(huán)境因素有關，包括營養(yǎng)不良、糖基化修飾作用的改變、缺血再灌注損傷、鈣缺乏、氧化應激、DNA損傷和能量不足等情況[18]。生理性蛋白質折疊量增加，導致細胞內質網(wǎng)合成蛋白質的功能紊亂，出現(xiàn)大量的蛋白質折疊錯誤，錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網(wǎng)腔中，即為ERS。當應激發(fā)生后，ERS的關鍵因子GRP78表達上調，蛋白質合成被抑制、錯誤折疊和未折疊蛋白質加速降解，從而使細胞內質網(wǎng)負荷工作得以緩解，可暫緩ERS[19]。當ERS異常時，會導致未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）的發(fā)生，從而保護細胞。UPR的下游有三種跨膜蛋白，即蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase， PERK）、肌醇激酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1）和活化轉錄因子6（activating transcription factor 6， ATF6）[20]。在細胞生理功能正常時，這三種跨膜蛋白處于無活性狀態(tài)，分別與GRP78結合。當出現(xiàn)ERS時，上述3種蛋白質與GRP78解離，與未折疊蛋白結合從而啟動UPR。UPR啟動后，PERK、IRE-1、ATF6與未折疊或錯誤折疊的蛋白質結合，從而使在內質網(wǎng)內堆積的未折疊或錯誤折疊的蛋白質減少，使其負荷減輕并恢復正常功能，對細胞起到保護作用[21]。嚴重的刺激引起程度過強或持續(xù)時間過長的ERS反應時，損傷超過修復能力，UPR不能啟動，PERK、ATF6和IRE-1未折疊或錯誤折疊的蛋白質的結合量遠遠小于內質網(wǎng)內堆積的未折疊或錯誤折疊的蛋白質，此時PERK、ATF6和IRE-1會啟動凋亡機制，誘導細胞凋亡。與之相應凋亡機制包括：①DNA損傷誘導基因153（GIDD153）的激活轉錄；②C.Jun氨基酸末端激酶（C-Jun N.terminalkinase）通路的激活；③內質網(wǎng)特有的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的激活等。內質網(wǎng)應激時PERK/eIF2、ATF6和IREl/XBP1信號途徑均被激活，并且誘導CHOP的表達。CHOP基因抑制轉錄因子C/EBP和內質網(wǎng)氨基肽酶1（ERAP1）的表達，可抑制細胞周期過程中從G1到S期的轉換。CHOP在內質網(wǎng)應激時可以介導GADD34和內質網(wǎng)氧化物蛋白（endoplasmic oxidoreductin 1 like protein，Ero-Lα）的激活與表達。GADD34可以使真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化真核啟動因子2α抗體（Ser51）去磷酸eIF2α的Ser51去磷酸化，刺激蛋白的合成。Ero-Lα可以引起氧化應激的發(fā)生，從而促進細胞凋亡。細胞中缺乏CHOP時，細胞凋亡下降，CHOP過表達則能促進細胞凋亡，CHOP在ERS誘導的細胞凋亡中發(fā)揮促凋亡作用。J-NK的激活通路可以通過多條途徑誘導細胞凋亡。吸煙可通過內質網(wǎng)應激下游PERK/eIF2/CHOP信號通路促進CHOP表達，啟動細胞凋亡。而ERS的下游PI3K/Akt信號通路則對內質網(wǎng)應激細胞起保護作用，從而促進COPD的發(fā)生與發(fā)展。

2 內質網(wǎng)應激的下游PI3K-Akt信號通路對內質網(wǎng)應激細胞起保護作用

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化。此外，其本身也具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。PI3K的構象改變和其與某些因子結合會使其激活。其激活方式如下：①與含有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構象改變而被激活。②通過原癌基因c-ras表達的產(chǎn)物Ras和催化亞基p110直接結合導致PI3K的活化。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K可以使Akt活化。有活性的Akt可以誘導各種編碼抗凋亡蛋白基因表達或發(fā)生信號偶聯(lián)而抑制細胞凋亡發(fā)生，進而促進細胞生成[22]。當細胞外沒有刺激信號時，p85調節(jié)亞基與p110催化亞基與PI3K結合，此時的PI3K沒有活性，當機體損傷致缺血在灌注損傷、鈣缺乏、氧化應激、DNA損傷和能量不足等情況時，調節(jié)亞基p85與催化亞基p110之間的相互作用受抑制，隨后PI3K/Akt通路激活，活化的Akt通過磷酸化作用于一系列細胞內蛋白從而介導下游反應[23]。ERS過度會導致細胞凋亡，PI3K/Akt通路可能對ERS存在負調節(jié)作用。有研究表明，PI3K/Akt通路能夠通過對GADD153的誘導，對內質網(wǎng)應激細胞起保護作用[10]。另外，PI3K/Akt通路也可通過對ERS誘導GRP78表達增加中發(fā)揮保護作用[24]。細胞處于生理狀態(tài)下時，GRP78的表達水平較低，當各種刺激引起內質網(wǎng)應激時，GRP78的表達量會顯著增加，表現(xiàn)出保護細胞受損的功能[25]。研究表明當P13K/Akt信號通路激活受阻時，ERS引起的GRP78表達顯著下降，而上調P13K/Akt信號通路活性時則誘導GRP78表達，PI3K/Akt通路通過抑制蛋白酶體，使GRP78蛋白降解，穩(wěn)定性增加，發(fā)揮調控作用[26]。

3 Lyn激酶是PI3K/Akt通路的激活劑

Lyn激酶是Src家族成員之一，是一類非受體型蛋白酪氨酸激酶，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。Lyn激酶的N末端有獨特的結構域、SH3結構域、SH2結構域，C末端有一個保守酪氨酸磷酸化位點，主要通過其N末端與細胞膜表面蛋白的胞漿內結構域相連接，從而發(fā)揮信號轉導作用。Lyn激酶與其他Src家族激酶成員一樣通過其N末端SH2/SH3結構域以及磷酸化狀態(tài)調節(jié)蛋白質相互作用[27]。Lyn激酶可通過多種信號途徑參與氣道重塑和炎癥反應，具有雙向調節(jié)細胞信號的作用。細胞內缺乏Lyn激酶，可引起氣道高反應、氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生。研究表明，配體酪氨酸激酶受體系統(tǒng)是PI3K/Akt通路的激活劑[28]。PI3K不僅具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K可分為3類，其結構與功能不同。I類PI3K含有1個調節(jié)亞基和一個催化亞基，為異源二聚體，調節(jié)亞基通常稱為p85，含有SH2和SH3結構域，與含有相應結合位點的靶蛋白相作用。Lyn激酶的N基末端含有與之相應結合SH2和SH3結構域結合位點，表明Lyn激酶可誘導PI3-K/Akt通路激活。

4 Lyn激酶缺乏誘導IL-17顯著增加

IL-17可介導多種炎癥反應和自身免疫反應，COPD多表現(xiàn)為氣道的慢性炎癥，IL-17在COPD發(fā)生的炎癥過程中起重要作用[29]。IL-17參與COPD肺氣腫表型的發(fā)生機制尚不清楚。IL-17可以特異性地和選擇性地將嗜中性粒細胞募集到氣道中，IL-17對氣道上皮中黏蛋白基因表達的影響與黏液產(chǎn)生增加有關。COPD的病理表現(xiàn)特征為氣道炎癥和黏液分泌過多，黏液分泌過多是COPD的病理生理變化之一，IL-17可能在COPD的發(fā)展中起重要作用。在吸入卵白蛋白（OVA）的小鼠中，抗IL-17抗體對IL-17活性的抑制顯著降低了氣道炎癥細胞數(shù)量的增加，IL-17可能在小鼠中香煙煙霧誘導的COPD中的氣道中性粒細胞炎癥中起關鍵作用。有研究表明，Lyn -/-小鼠對DSS誘導的結腸炎易感性與結腸T細胞對IL-17和IFN-γ的過度產(chǎn)生有關。與空白對照小鼠相比，免疫活性的Lyn -/-小鼠表現(xiàn)出顯著升高的IL-17和IFN-γ。因此，受共生微生物群影響的腸T細胞群的穩(wěn)態(tài)調節(jié)可使Lyn -/-小鼠易于對由IL-17和（或）IFN-γ產(chǎn)生驅動的炎性疾病敏感。從最初的Lyn -/-菌落到已經(jīng)重新獲得的Lyn -/-小鼠的微生物均可檢測到IFN-γ（+）CD4+和CD8+T細胞以及IL-17的顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明Lyn的缺乏足以誘導T細胞產(chǎn)生的IL-17和IFN-γ增加[30]。Lyn激酶缺乏誘導增多的IL-17在COPD發(fā)生機制中有重要作用。PI3K/Akt通路也能夠通過對GADD153的誘導，對ERS細胞起保護作用。Lyn激酶缺乏一方面可能誘導T細胞產(chǎn)生的IL-17增加，增加的IL-17會引起肺內中性粒細胞的募集，引起持續(xù)炎癥反應從而加重COPD的慢性炎癥過程。另一方面Lyn激酶缺乏使ERS下游PI3K/Akt通路不能激活，PI3K/Akt通路對細胞的保護作用不能發(fā)揮，細胞發(fā)生凋亡，中性粒細胞在極性化和趨化過程受阻，中性粒細胞的免疫防御能力下降均加重COPD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Lyn激酶缺乏在IL-17高表達的情況下可能抑制PI3K/Akt通路的激活，而激活的PI3K/Akt通路主要通過誘導內質網(wǎng)應激中的GRP78分子表達發(fā)揮保護作用。PI3K/Akt通路也能夠通過對GADD153的誘導，對ERS細胞起保護作用。當ERS持續(xù)存在情況下，內質網(wǎng)應激過度，ERS下游對細胞的保護通路PI3K/Akt通路不能激活，最終導致細胞凋亡。此外，PI3K/Akt通路在中性粒細胞的極性化和趨化過程中起重要作用，中性粒細胞在此過程中往往表現(xiàn)出免疫防御反應，對COPD病情有一定緩解作用。PI3K/Akt通路不能激活，中性粒細胞在極性化和趨化過程受阻，以及IL-17高表達時，肺內中性粒細胞募集活化，爆發(fā)了一系列炎癥反應，進一步促進了COPD的發(fā)生發(fā)展。