顧 湘，賈世翀，葛盛芳，范先群

細(xì)胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，參與生物體復(fù)雜的生命活動(dòng)。在真核生物中，細(xì)胞內(nèi)形成了不同的區(qū)室，以確保不同的生化反應(yīng)在各自區(qū)室內(nèi)獨(dú)立、高效且有序地進(jìn)行。細(xì)胞器利用其磷脂雙分子膜在細(xì)胞內(nèi)形成相對(duì)獨(dú)立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)揮特定的功能。此外，細(xì)胞內(nèi)存在許多無(wú)膜區(qū)室，如細(xì)胞質(zhì)中的壓力顆粒(Stress Granules，SG)，細(xì)胞核中的核仁、斑點(diǎn)、Cajal小體等。這些無(wú)膜區(qū)室，也被稱為“生物分子凝聚體”。研究表明，生物分子凝聚體的組裝通過(guò)“液-液相分離”(Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS)，通常簡(jiǎn)稱為相分離實(shí)現(xiàn)[1]。

1 相分離的概念

相分離指在相對(duì)均勻的介質(zhì)中，細(xì)胞內(nèi)的分子因理化性質(zhì)的差異自發(fā)地聚集或分離，形成相對(duì)獨(dú)立的無(wú)膜區(qū)室[2]。相分離是依賴于多價(jià)相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，生物凝聚體中的分子因其之間的多價(jià)相互作用與外部溶液中的分子解離，在局部形成超過(guò)濃度閾值的高度濃縮的“相”，促使生物分子凝聚體中的分子重新排列，并與外部溶液中的分子發(fā)生交換。生物大分子之間的多價(jià)相互作用可通過(guò)蛋白質(zhì)的多位點(diǎn)修飾，蛋白質(zhì)的固有無(wú)序區(qū)域(Intrinsically Disordered Regions，IDRs)，RNA的核苷酸重復(fù)擴(kuò)展等來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。

2 相分離的研究歷史

自從19世紀(jì)30年代在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)觀察到第一個(gè)無(wú)膜區(qū)室——核仁以來(lái)[4]，研究者們發(fā)現(xiàn)幾乎所有真核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上都存在類似的結(jié)構(gòu)，并對(duì)其成分、位置和功能有了一定的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)其形成原因和物理性質(zhì)長(zhǎng)期以來(lái)知之甚少。一些早期的研究認(rèn)為，這些生物分子凝聚體是不穩(wěn)定的。2005年，有研究將Cajal小體描述為“漂浮于半流質(zhì)核質(zhì)中的半流質(zhì)球體”[5]，但一直缺乏證據(jù)證明其明確的物理性質(zhì)。2009年，Brangwynne等人[6]在顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲的P顆粒形成過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)P顆粒并非固體顆粒，而是以“液滴”形式存在，且具備以下特點(diǎn)：①在游離狀態(tài)下呈球形(表面張力作用下)，附于細(xì)胞核表面時(shí)為非球形，類似于液體在固體表面的濕潤(rùn)狀態(tài)；②剪切力作用下可在其他結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為變形、流動(dòng)、裂變；③相互碰撞后融合并松弛成球形；④光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)表明其內(nèi)部分子可流動(dòng)并與外部溶液中的分子快速交換。他們推測(cè)在細(xì)胞中存在一種方式，使細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集，維持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)處于一定的“秩序”中。隨后，核仁和其他生物分子凝聚體中也發(fā)現(xiàn)存在類似的“液滴”現(xiàn)象[7]。2012年，Kato等[8]分別在體外重構(gòu)出了與體內(nèi)生物分子凝聚體類似的蛋白質(zhì)和RNA液滴，揭示了生物分子凝聚體是一種相分離現(xiàn)象，且可以通過(guò)體外重構(gòu)相分離模擬體內(nèi)生物分子凝聚體的性質(zhì)和功能。

3 相分離的生理功能

相分離參與調(diào)控細(xì)胞代謝。在核苷酸代謝中，胞苷三磷酸(Cytidine Triphosphate，CTP)合成酶是嘧啶合成的關(guān)鍵酶，催化尿苷三磷酸(Uridine Triphosphate，UTP)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為CTP和谷氨酸。在冷凍電鏡下觀察到，人的CTP合成酶通過(guò)相分離形成凝聚體。并且，增加底物UTP和腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)可促進(jìn)其凝聚，而增加產(chǎn)物CTP和腺苷二磷酸(Adenosine Diphosphate，ADP)則抑制其凝聚[9]。以上研究提示代謝酶的相分離有利于促進(jìn)其酶活性。此外，在脂肪酸代謝中，乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)催化乙酰輔酶A的羧化反應(yīng)參與脂肪酸合成[10]。當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時(shí)，ACC會(huì)和檸檬酸鹽結(jié)合形成ACC-檸檬酸鹽二聚體并組裝成具有更高酶活性的凝聚體，促進(jìn)脂肪酸的合成。然而，當(dāng)脂肪酸合成產(chǎn)物過(guò)多時(shí)，凝聚體內(nèi)的二聚體則被局限于非活性構(gòu)象中，抑制其酶的活性[11]。以上研究表示，在不同的環(huán)境中，相分離可通過(guò)調(diào)節(jié)酶的凝聚，激活或抑制酶的活性，從而調(diào)控細(xì)胞代謝。

相分離參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LAT-Grb2-SOS可通過(guò)相分離在膜表面形成凝聚體，延長(zhǎng)SOS在膜上的停留時(shí)間，從而增強(qiáng)SOS對(duì)Ras的激活作用，調(diào)控T細(xì)胞活化[12]。突觸后致密區(qū)(Postsynaptic Density，PSD)是緊貼于突觸后膜的蛋白質(zhì)密集區(qū)，它使受體靠近神經(jīng)遞質(zhì)釋放區(qū)域，確保突觸間信號(hào)的傳遞。Zeng等[13]通過(guò)體外重建證明了4個(gè)主要的PSD支架蛋白，PSD-95、GKAP、Shank和Homer可以在生理濃度通過(guò)相分離形成凝聚體，并且這些凝聚體可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚集及阻止抑制性突觸后蛋白的進(jìn)入，由此推測(cè)相分離參與調(diào)控突觸信號(hào)傳導(dǎo)。

相分離參與調(diào)控基因表達(dá)。異染色質(zhì)通過(guò)異染色質(zhì)蛋白1(Heterochromatin Protein 1，HP1)壓縮染色質(zhì)和聚集配體，從而介導(dǎo)基因沉默。研究發(fā)現(xiàn)，HP1通過(guò)相分離形成凝聚體，將包裝緊密的染色體封閉在凝聚體中，阻止其表達(dá)，從而使目的基因沉默[14]。此外，通過(guò)相分離形成的細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜區(qū)室核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP)可以通過(guò)調(diào)控mRNA的定位控制蛋白質(zhì)翻譯的產(chǎn)量[15]。

相分離參與調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞核中的脅迫敏感蛋白在脅迫條件下發(fā)生錯(cuò)誤折疊，由核質(zhì)彌散狀態(tài)聚集至核仁中，與核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin1，NPM1)通過(guò)相分離結(jié)合，降低移動(dòng)速度從而避免錯(cuò)誤折疊蛋白的不可逆聚集。同時(shí)，分子伴侶Hsp70進(jìn)入核仁與NPM1結(jié)合，修復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白，使其在脅迫條件消失后重新回到核質(zhì)發(fā)揮功能。然而，當(dāng)脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或分子存在致病結(jié)構(gòu)時(shí)，核仁將無(wú)法幫助錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)功能[16]。以上研究提示核仁可以通過(guò)相分離，修復(fù)折疊紊亂蛋白，成為相分離蛋白質(zhì)控中心。

4 相分離與癌癥

相分離參與調(diào)控細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)等多種生物體生理功能，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)意義重大。最近，相分離與癌癥之間的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。基因組不穩(wěn)定性導(dǎo)致的細(xì)胞異常增殖分化是癌癥的重要發(fā)病機(jī)制。相分離參與了機(jī)體維持基因組穩(wěn)定的多個(gè)過(guò)程，參與了與癌基因和抑癌基因相關(guān)的多種調(diào)控，因此，相分離與基因組不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的癌癥密切相關(guān)。

4.1 相分離影響DNA修復(fù)過(guò)程 在人體的細(xì)胞中，代謝活動(dòng)和環(huán)境因素(如紫外線和放射線)造成不計(jì)其數(shù)的DNA損傷，DNA修復(fù)是人體防止基因組損傷和突變的必要過(guò)程。相分離參與DNA修復(fù)蛋白的凝聚過(guò)程，相分離異常導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白凝聚體的缺乏會(huì)干擾DNA修復(fù)，導(dǎo)致受損DNA的不斷堆積和基因組不穩(wěn)定，從而驅(qū)動(dòng)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。如DNA修復(fù)蛋白R(shí)ad52通過(guò)相分離在體內(nèi)或體外凝聚，這個(gè)過(guò)程依賴于Rad52蛋白的長(zhǎng)IDRs。當(dāng)使用1,6-己二醇或通過(guò)截短其IDRs破壞Rad52的相分離時(shí)，DNA損傷的敏感性提高，提示Rad52的相分離在DNA修復(fù)中有重要意義[17]。此外，p53結(jié)合蛋白1(p53-Binding Protein 1,53BP1)凝聚體促進(jìn)非同源末端連接，在DNA修復(fù)中起重要作用。研究表明，在小鼠體內(nèi)，如發(fā)生相分離異常導(dǎo)致53BP1凝聚體缺乏，會(huì)導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和輻射敏感性增加，并且與腫瘤的快速進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)[18]。DNA損傷時(shí)，DNA修復(fù)酶PARP1定位于損傷部位并發(fā)生自發(fā)的聚ADP核糖基化，觸發(fā)FET蛋白家族(包括FUS、EWS、TAF蛋白)相分離，聚集損傷的DNA，促使其連接修復(fù)，增加DNA修復(fù)效率。

4.2 相分離影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控 在癌癥中，DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控往往受到干擾，從而加速了癌癥的進(jìn)程。超級(jí)增強(qiáng)子是增強(qiáng)子集合體，比單個(gè)增強(qiáng)子具有更高水平的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的能力。由于超級(jí)增強(qiáng)子能調(diào)控癌癥中的關(guān)鍵致癌基因，使其達(dá)到更高水平的轉(zhuǎn)錄量，在加速癌癥進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。最近的研究表明，含有IDRs的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄共激活因子和RNA聚合酶Ⅱ在超級(jí)增強(qiáng)子的靶基因處相分離形成生物分子凝聚體從而激活這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表達(dá)，揭示了超級(jí)增強(qiáng)子通過(guò)相分離聚集轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件[19]。

EWS和FUS蛋白能導(dǎo)致兒童結(jié)締組織癌的發(fā)生，包括黏液樣脂肪肉瘤和尤文肉瘤。在這些癌癥中，EWS和FUS蛋白N-末端的IDRs介導(dǎo)相分離并和轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域(如FLI1和CHOP)連接。研究表明，連接形成的融合蛋白FUS-CHOP和EWS-FLI1可以促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性[20]。

4.3 相分離影響癌基因和抑癌基因的表達(dá) E3泛素連接酶斑點(diǎn)型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(Speckle-typePOZ Protein，SPOP)調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)蛋白的降解，如腫瘤抑制因子PTEN、ERK磷酸酶、Hedgehog途徑轉(zhuǎn)錄因子Gli2等。SPOP是E3泛素連接酶底物的配體，定位于核斑點(diǎn)處。其突變引起蛋白調(diào)節(jié)途徑的失調(diào)可導(dǎo)致前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種實(shí)體腫瘤[21]。此外，SPOP的底物死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Death Domain-associated Protein，DAXX)定位于早幼粒細(xì)胞(Promyelocytic leukemia，PML)小體，參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等。DAXX可以通過(guò)下調(diào)腫瘤抑制因子的轉(zhuǎn)錄活性，如ETS1、p53和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[22]。盡管SPOP和DAXX分別定位于兩種生物分子凝聚體核斑點(diǎn)和PML小體中，它們共表達(dá)時(shí)會(huì)形成新的生物分子凝聚體SPOP/DAXX小體。癌癥相關(guān)的SPOP突變會(huì)干擾相分離形成SPOP/DAXX小體，導(dǎo)致PML小體中的DAXX活性增長(zhǎng)，進(jìn)而加速腫瘤生長(zhǎng)[23]。

此外，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的抑癌因子p53會(huì)發(fā)生錯(cuò)義突變，與其同源物p63和p73形成生物分子凝聚體，導(dǎo)致其抑癌功能喪失，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。在高級(jí)別漿液性卵巢癌的動(dòng)物模型中已證實(shí)，抑制p53凝聚體的形成，可恢復(fù)其調(diào)節(jié)靶基因抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞死亡的能力[24]。

4.4 相分離影響PML小體的形成 PML小體是通過(guò)相分離組裝的生物分子凝聚體，參與了DNA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等多種生理過(guò)程。同時(shí)，PML小體也與多種癌癥相關(guān)。在急性早幼粒細(xì)胞白血病中，染色體易位導(dǎo)致PML蛋白N-末端和維甲酸受體α(Retinoic Acid Receptor-alpha，RARα)結(jié)合，形成PML-RARα，破壞了PML小體，形成了分散的微斑點(diǎn)。PML微斑點(diǎn)缺乏轉(zhuǎn)錄共激活因子，延遲DNA修復(fù)蛋白的凝聚和ATM的激活，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[25]。

4.5 相分離影響端粒維持機(jī)制 在真核生物細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中，端粒會(huì)不斷地縮短，導(dǎo)致端粒介導(dǎo)的細(xì)胞衰老和凋亡。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)端粒維持機(jī)制避免端?？s短實(shí)現(xiàn)持續(xù)復(fù)制。大多數(shù)腫瘤通過(guò)激活端粒酶的方式維持端粒，而有一部分腫瘤，如肉瘤，內(nèi)分泌腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等則通過(guò)同源重組維持端粒，這一過(guò)程稱為替代端粒延長(zhǎng)機(jī)制(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT)[26]。ALT相關(guān)PML小體(ALT-associated PML Bodies，APBs)是觸發(fā)ALT的關(guān)鍵機(jī)制之一。端粒DNA的損傷誘導(dǎo)端粒蛋白發(fā)生SUMO化修飾，促使端粒在PML小體中聚集，通過(guò)相分離形成生物分子凝聚體APBs。APBs通過(guò)BLM和Rad52介導(dǎo)的DNA合成過(guò)程觸發(fā)ALT[27]。

4.6 相分離影響SG的形成 生物分子凝聚體SG也與癌癥有關(guān)。SG蛋白YB1參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，通過(guò)調(diào)控SG蛋白G3BP1促進(jìn)SG的組裝。研究表明，在腫瘤中YB1過(guò)表達(dá)與腫瘤耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)[28]。并且在小鼠腫瘤種植模型中發(fā)現(xiàn)，敲除YB1或G3BP1可通過(guò)減少SG的組裝抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。由此推測(cè)，YB1通過(guò)促進(jìn)SG的組裝加速腫瘤進(jìn)展。

此外，KRAS基因介導(dǎo)Ras/MAPK信號(hào)通路控制細(xì)胞的增殖分化，其突變會(huì)導(dǎo)致許多組織細(xì)胞發(fā)生惡變。研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變的腫瘤細(xì)胞中，SG組裝明顯增加；若抑制突變細(xì)胞中的SG組裝，細(xì)胞會(huì)對(duì)外界的壓力更敏感，提示SG組裝可增加腫瘤對(duì)壓力的適應(yīng)性[30]。

5 總結(jié)與展望

多價(jià)相互作用介導(dǎo)的相分離驅(qū)動(dòng)人體內(nèi)多種生物分子凝聚體的組裝，參與調(diào)控細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程，幫助維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，相分離異常破壞機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。癌癥是與相分離密切相關(guān)的疾病之一，除了相分離異常導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定能促使癌癥的發(fā)展以外，部分相分離驅(qū)動(dòng)形成的生物分子凝聚體本身在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地。相分離與癌癥之間關(guān)系的研究，目前主要停留于其組裝形成的生物分子凝聚體在癌癥中的作用，而缺乏相分離的動(dòng)態(tài)過(guò)程在癌癥中的內(nèi)在機(jī)制研究。因此，相分離與癌癥的關(guān)系仍需進(jìn)一步的探索。盡管目前可以通過(guò)體外重構(gòu)相分離模擬體內(nèi)生物分子凝聚體的性質(zhì)和功能，但是一方面由于生物分子凝聚體的液體特性和動(dòng)態(tài)過(guò)程，現(xiàn)有的光學(xué)顯微技術(shù)難以深入觀測(cè)相分離的精細(xì)結(jié)構(gòu)；另一方面體內(nèi)的環(huán)境和分子調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，體外模擬條件無(wú)法完全替代。因此，需要發(fā)展新的技術(shù)和不斷優(yōu)化體外相分離條件，進(jìn)一步挖掘相分離的具體過(guò)程、精細(xì)結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)調(diào)控、起始和終止信號(hào)。此外，在相分離與癌癥的關(guān)系方面，與癌癥表型相關(guān)的相分離分子機(jī)制仍需深入探索。未來(lái)的研究方向可聚焦于相分離的理化功能，如選擇性富集分子，增加分子間相互作用概率和改變分子構(gòu)象在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，以及尋找調(diào)節(jié)相分離的關(guān)鍵分子，如激酶和分子伴侶，以便深入挖掘癌癥的致病機(jī)制和調(diào)控方式，尋找癌癥治療的新靶點(diǎn)。