唱煥良， 邵長(zhǎng)優(yōu)， 孟 蕾， 楊 俊

（北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

凍凝膠是一種新型凝膠材料，其形成過(guò)程是通過(guò)聚合物前體溶液在低溫條件下通過(guò)形成冰晶來(lái)提高未冷凍部分溶液的濃度，利用高濃度的凝膠化反應(yīng)制備出高固含量和高強(qiáng)度的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這種方法制備的凍凝膠通常具有分布均勻、相互連通的孔狀結(jié)構(gòu)，這為細(xì)胞附著、滲透、增殖和變異提供了適宜的條件[1]，因此在組織工程領(lǐng)域備受關(guān)注。絲蛋白（SF）是一種無(wú)生理活性的天然高分子材料，具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、生物相容性好且可降解等優(yōu)點(diǎn)[2]。Santin 等[3]研究表明SF 具有較低的炎癥反應(yīng)；吳海濤等[4]證明SF 對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的黏附增殖作用，這表明SF 在組織工程領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景；段郁等[5]通過(guò)丁醇誘導(dǎo)和冷凍融化法制備了柞蠶絲蛋白/桑蠶絲蛋白復(fù)合支架材料，該材料具有良好的生物相容性和細(xì)胞增殖速率，可應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域；Chen 等[6]向SF 溶液內(nèi)加入甲醇以誘導(dǎo)形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，之后通過(guò)冷凍融化過(guò)程制備凍凝膠用于氣管的修復(fù)。但是目前多數(shù)報(bào)道的SF 材料仍然存在韌性差、力學(xué)強(qiáng)度低、不易成型及吸水性差等不足之處[7]。

冷凍過(guò)程中的增濃效果已經(jīng)被證實(shí)對(duì)SF 結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成有著促進(jìn)作用[8]，但純SF 溶液通過(guò)凍融循環(huán)并不能形成穩(wěn)定的凍凝膠，因此需要加入交聯(lián)劑來(lái)促進(jìn)SF 交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的形成。聚乙二醇（PEG）是一種具有較好生物相容性的高分子材料，常與SF 共混以提高其性能。Burke 等[9]通過(guò)將PEG 與SF 共混來(lái)提高材料的親水性；Wang 等[10]研究表明，低分子量的PEG 可以促進(jìn)SF 結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成。但鮮有報(bào)道PEG 對(duì)復(fù)合材料力學(xué)性能影響機(jī)制的研究。

本文以PEG 為交聯(lián)劑，在不添加其他有機(jī)溶劑和化學(xué)交聯(lián)劑的前提下，僅通過(guò)簡(jiǎn)單的冷凍融化過(guò)程成功地制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的高強(qiáng)度SF 凍凝膠[11]。冷凍過(guò)程中SF 和PEG 之間的氫鍵作用促進(jìn)了SF 由無(wú)定型結(jié)構(gòu)向結(jié)晶結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，從而顯著增強(qiáng)了凍凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。溶脹后的凍凝膠壓縮模量可達(dá)到0.44 MPa，與天然軟骨（0.4～0.8 MPa）相似[12]，同時(shí)凍凝膠在壓縮實(shí)驗(yàn)中回復(fù)性能良好，可在壓縮至90%時(shí)不發(fā)生永久性形變和破裂；另外親水性PEG 的引入能夠提高凍凝膠的溶脹能力，這有助于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)組分迅速進(jìn)入支架內(nèi)部，為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)[13]。本研究為絲蛋白凝膠在組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶繭：山東漢興生物技術(shù)有限公司；碳酸鈉、溴化鋰、PEG（Mn=600）：麥克林公司；透析袋：截留分子量為8×103～1.2×104，北京藍(lán)弋科貿(mào)。所用試劑皆為市售分析純。

1.2 SF 水溶液的制備

稱取10 g 干蠶繭于2 L 碳酸鈉水溶液（5 g/L）中沸水脫膠30 min，將脫膠后的蠶絲用去離子水清洗2 遍并在60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重；將7 g 上述烘干蠶絲溶解于9.3 mol/L 的溴化鋰溶液中，70 ℃持續(xù)攪拌2 h，通過(guò)離心（10 min，104r/min）除去SF 溶液中不溶的雜質(zhì)；最后在清水中透析3 d，每天換水3 次去除溴化鋰從而獲得SF 水溶液。

1.3 SF/PEG 凍凝膠的制備

通過(guò)在PEG 溶液內(nèi)（w=0.1，膜截留分子量為2×104）反透析提高SF 水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（wSF）至0.08，0.12和0.16。取5 mL 上述不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SF 水溶液在300 r/min 的攪拌速率下，按PEG 與SF 的質(zhì)量比（mPEG/mSF）分別為0、0.10、0.25、0.50 加入一定量PEG 水溶液得到均勻的混合溶液；然后將該混合溶液裝入10 mL離心管內(nèi)并分別在-20 ℃和-56 ℃下冷凍12 h 或浸入液氮（-196 ℃）內(nèi)10 min；最后在室溫下融化后取出凍凝膠，并用去離子水清洗以去除未交聯(lián)的SF 和PEG。

1.4 SF/PEG 水凝膠的制備

取5 mL SF 水溶液（wSF=0.08），在300 r/min 的攪拌速率下，按mPEG/mSF分別為0、0.10、0.25、0.50，加入一定量PEG 水溶液以得到均勻的混合溶液，然后將混合溶液裝入10 mL 離心管內(nèi)并置于50 ℃烘箱內(nèi)2 h即可獲得SF/PEG 水凝膠。

1.5 測(cè)試與表征

凍凝膠經(jīng)冷凍干燥后放入液氮中脆斷，之后用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金處理，采用掃描電鏡（日本日立公司S-3500 型）觀察斷面形貌；樣品凍干后與KBr 混合壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛公司Thermo Scientific Nicolet iN10-MX 型）進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，掃描范圍為500～4 000 cm-1；通過(guò)萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)（德國(guó)Zwick 公司Z005 型）測(cè)試凝膠的力學(xué)性能，傳感器上限為300 N，樣品切割成圓柱體（高10 mm, 直徑10 mm），壓縮和拉伸速率均為20 mm/min，每組樣品不少于3 個(gè)并統(tǒng)計(jì)平均值以保持重復(fù)性；取凍凝膠樣品放入60 ℃烘箱烘干至恒重，稱重記為m0，再將烘干后的樣品放入1 L 去離子水中浸泡，每隔30 s 取出樣品，用濾紙吸干表面水分，稱重記為mt，如此反復(fù)直至質(zhì)量保持恒定，繪制出溶脹比（mt/m0）隨時(shí)間（t）的變化曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍凝膠的形成機(jī)理

圖1（a）是SF/PEG 凍凝膠（wSF=0.08）的紅外譜圖，純SF 水溶液制備的凍凝膠在代表無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的1 650 cm-1處出現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰，而加入PEG 的凍凝膠特征峰則明顯向表示結(jié)晶結(jié)構(gòu)的1 620 cm-1處偏移。

此外，本文對(duì)紅外譜圖進(jìn)行了曲線積分以定量分析不同mPEG/mSF凍凝膠的構(gòu)象組成（圖1（b）），當(dāng)mPEG/mSF=0.10 時(shí)，凍凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量達(dá)到55%，而同濃度下純SF 凍凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量?jī)H為42%；當(dāng)mPEG/mSF=0.25 時(shí)，結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量進(jìn)一步提高至65%。上述結(jié)果表明PEG 可促進(jìn)SF 凍凝膠結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成，這可能是由于PEG 分子上的―OH 和SF 分子上―NH 之間的氫鍵增強(qiáng)了SF 分子間的相互作用，從而促進(jìn)SF分子構(gòu)象從無(wú)定形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，相似的氫鍵也被證實(shí)存在于SF 與羥丙基甲基纖維素[14,15]或丙醇[16]的共混復(fù)合材料中。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本文通過(guò)紅外光譜進(jìn)一步研究了凝膠構(gòu)象和氫鍵的變化。之前的研究表明氫鍵的形成會(huì)降低成鍵電子云密度，減小化學(xué)鍵力常數(shù)，從而導(dǎo)致伸縮振動(dòng)吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)[17]。如圖1（c）所示，與SF 水凝膠相比，SF/PEG 凍凝膠的羥基吸收峰從3 441 cm-1移動(dòng)到3 281 cm-1，這表明在凍凝膠中PEG 與SF 形成了氫鍵。此外，本文還在50 ℃條件下制備了不同mPEG/mSF的SF/PEG 水凝膠，與純SF 水凝膠相比，加入PEG 的水凝膠在結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量上沒(méi)有明顯的改變，這進(jìn)一步表明冷凍融化過(guò)程中的高濃條件增強(qiáng)了分子之間的相互作用，有利于形成氫鍵從而增強(qiáng)凍凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。

圖 1 SF/PEG 凍凝膠（wSF=0.08）的紅外譜圖（a）與結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量（b）；純SF 水凝膠和凍凝膠（wSF=0.08，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）的紅外譜圖Fig. 1 FT-IR spectra （a） and β-sheet content （b） of SF/PEG cryogels （wSF=0.08）（b）; FT-IR spectra of hydrogel and cryogel （wSF=0.08,mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃） （c）

2.2 凍凝膠的微觀形貌

不同mPEG/mSF凍凝膠的微觀形貌如圖2（a）所示，凍凝膠的孔徑隨著mPEG/mSF的降低而減小，從而網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加密集。當(dāng)mPEG/mSF=0.10 時(shí)，樣品呈現(xiàn)片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；隨著mPEG/mSF提高至0.25 和0.50，凍凝膠出現(xiàn)高度連通的孔狀結(jié)構(gòu)，其中mPEG/mSF=0.50 的凍凝膠孔壁最為致密，表明此時(shí)SF 與PEG 之間相互作用更加強(qiáng)烈，有利于形成致密凝膠網(wǎng)絡(luò)。

圖 2 mPEG/mSF（TFreeze=-20 ℃， wSF=0.08）（a）、 TFreeze（wSF=0.08， mPEG/mSF=0.50）（b）和wSF（TFreeze=-20 ℃， mPEG/mSF=0.50）（c）對(duì) SF/PEG 凍凝膠微觀形貌的影響Fig. 2 Effects of mPEG/mSF（TFreeze=-20 ℃, wSF=0.08）（a）, TFreeze （mPEG/mSF=0.50, wSF=0.08） （b） and wSF （TFreeze=-20 ℃, mPEG/mSF=0.50） （c） on the microstructure of SF/PEG cryogels

圖2（b）為不同TFreeze下制備的凍凝膠的掃描電鏡圖，隨著冷凍溫度的降低，凍凝膠孔徑急劇減小，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更加密集。綜上所述，當(dāng)TFreeze為-20 ℃，mPEG/mSF=0.50 時(shí)凍凝膠具有分布均勻、互相連通的開(kāi)孔結(jié)構(gòu)，滿足了組織修復(fù)材料的需求。

wSF對(duì)凍凝膠微觀形貌的影響如圖2（c）所示，樣品的孔徑隨著wSF的提高而降低，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也變得更加致密。這是由于隨著wSF增加，單位體積內(nèi)SF 分子增多，從而導(dǎo)致作為多孔結(jié)構(gòu)模板的冰晶生長(zhǎng)受抑制，孔徑尺寸也隨之變小。

2.3 凍凝膠的力學(xué)性能

如圖3（a）所示，凍凝膠可以承受90%以上的壓縮形變而不發(fā)生斷裂和變形，其循環(huán)壓縮曲線（圖3（b））也表明凍凝膠回復(fù)性能優(yōu)異。與SF 水凝膠相比，SF/PEG 凍凝膠具有更加優(yōu)異的力學(xué)性能。由SF/PEG 水凝膠和凍凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖3（c））可知，水凝膠在200 kPa 的應(yīng)力下即發(fā)生斷裂，而凍凝膠則可以承受高達(dá)3 500 kPa 的應(yīng)力，這是由于SF 與PEG 之間的氫鍵作用增強(qiáng)了凍凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，這種具有較高韌性和優(yōu)異回彈能力的凍凝膠為其用于組織修復(fù)提供了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[18]。

不同TFreeze和mPEG/mSF條件下SF 凍凝膠的力學(xué)性能如表1 所示，凍凝膠的拉伸斷裂應(yīng)力和斷裂伸長(zhǎng)率隨著mPEG/mSF的增加而提高；在壓縮實(shí)驗(yàn)中，mPEG/mSF=0.10 的凍凝膠壓縮強(qiáng)度為246.75 kPa，而mPEG/mSF為0.25 和0.50 的凍凝膠則可承受高達(dá)3 500 kPa 的應(yīng)力而不發(fā)生破裂。在-56 ℃和液氮冷凍條件下制備的凍凝膠強(qiáng)度太差，無(wú)法進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，在壓縮實(shí)驗(yàn)中，凍凝膠的強(qiáng)度隨著TFreeze的降低而降低。綜上所述，相同SF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，當(dāng)mPEG/mSF和TFreeze分別為0.50 和-20 ℃時(shí)，凍凝膠具有最佳的壓縮強(qiáng)度。

表2 所示是wSF對(duì)凍凝膠的力學(xué)性能的影響。凍凝膠的力學(xué)性能隨著wSF的提高而顯著提高。這是由于隨著wSF的增加，單位體積內(nèi)SF 分子鏈密度增加，其形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為致密。當(dāng)wSF=0.16 時(shí)，凍凝膠的拉伸模量可以達(dá)到4.15 MPa，高于大多數(shù)的常規(guī)天然高分子水凝膠（10～100 kPa）[19]或者雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠（100～1 000 kPa）[20,21]。此外，凍凝膠在保持優(yōu)異的拉伸模量的同時(shí)還具有較高的斷裂伸長(zhǎng)率，即使拉伸模量達(dá)到4.15 MPa 依然可以拉伸至100%，從而賦予SF/PEG 凍凝膠出色的韌性（680.81 kJ/m3），這與目前報(bào)道的兩相溶劑誘導(dǎo)制備的SF 水凝膠相當(dāng)（600 kJ/m3）[22]。

圖 3 SF/PEG 凍凝膠（wSF=0.16，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）的壓縮圖片（a）和循環(huán)壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線（b）；SF/PEG 凍凝膠（wSF=0.08，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）和SF/PEG 水凝膠（mPEG/mSF=0.50）的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線（c）Fig. 3 Digital photos （a） and cycle compressive stress-strain curves （b） of SF/PEG cryogel （wSF=0.16，mPEG/mSF=0.50，TFreeze=-20 ℃）;Compressive stress-strain curves of SF/PEG cryogel （wSF=0.08， mPEG/mSF=0.50， TFreeze=-20 ℃） and SF/PEG hydrogel（mPEG/mSF=0.50） （c）

表 1 mPEG/mSF 和TFreeze 對(duì)凍凝膠力學(xué)性能的影響Table 1 Effects of mPEG/mSF and freezing temperature on mechanical properties of cryogels

表 2 wSF 對(duì)凍凝膠力學(xué)性能的影響Table 2 Effects of wSF on the mechanical properties of cryogels

2.4 凍凝膠的溶脹性能

由于細(xì)胞生長(zhǎng)在水環(huán)境中，組織修復(fù)材料要求具有一定的吸水能力以利于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)組分迅速進(jìn)入支架內(nèi)部，從而為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)。因此，快速的溶脹吸水速率對(duì)于組織修復(fù)材料顯得極其重要。由凍凝膠的溶脹動(dòng)力學(xué)曲線（圖5（a））可知，當(dāng)mPEG/mSF=0.10 時(shí)，樣品浸泡時(shí)幾乎不發(fā)生溶脹，這是因?yàn)槠湓诤娓珊篌w積急劇縮?。▓D5（b）），喪失了原有片層結(jié)構(gòu)，從而顯著增加水分子的擴(kuò)散阻力（圖5（c））；當(dāng)mPEG/mSF提高至0.25 和0.50 時(shí)，凍凝膠的平衡吸水溶脹比從7.06 g/g 升高至9.15 g/g，同時(shí)溶脹平衡的時(shí)間也從200 s 降低為160 s。這是由于較高mPEG/mSF的凍凝膠的孔徑較大，更有利于水分的吸收，同時(shí)PEG 的親水性也提高了樣品的溶脹速率。

圖 4 mPEG/mSF 對(duì)凍凝膠溶脹性能的影響（a）；樣品烘干前后照片（b）；凍凝膠烘干前后的掃描電鏡圖（c）Fig. 4 Effects of mPEG/mSF on the swelling properties of the cryogels （a）; Digital photos of the cryogels with different mPEG/mSF before and after drying （b）; SEM images of the cryogels before and after drying（c）

3 結(jié) 論

（1）以PEG 為交聯(lián)劑，采用簡(jiǎn)單的冷凍融化法，成功制備出可調(diào)控微觀多孔形貌的SF/PEG 凍凝膠。

（2）冷凍融化過(guò)程中，PEG 可有效提高SF 凝膠材料的力學(xué)性能。

（3）wSF一定時(shí)，凍凝膠孔徑隨著TFreeze和mPEG/mSF的提高而增大。

（4）當(dāng)TFreeze=-20 ℃，mPEG/mSF=0.50 時(shí)，所得凍凝膠具有高度連通的開(kāi)孔結(jié)構(gòu)、較高的強(qiáng)度和優(yōu)異的溶脹性能。