李海霞， 何宏燕， 董秀琳， 常鈴雪， 劉昌勝

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

鈦金屬材料具有質(zhì)輕、無(wú)毒、易加工、生物相容性好、彈性模量與人骨相近等一系列優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于固定材料和矯形/牙科植入物[1,2]，但鈦植入材料在植入初期穩(wěn)定性不佳、成骨活性不足，進(jìn)而導(dǎo)致初期長(zhǎng)入緩慢，甚至引起關(guān)節(jié)松動(dòng)或脫落[3,4]。僅僅依靠金屬材料的表/界面結(jié)構(gòu)，縮短種植周期、促進(jìn)早期骨整合的作用有限，最為有效的方法是引入生長(zhǎng)因子[5]，該方法可加強(qiáng)種植材料與周圍細(xì)胞相互交流的生物學(xué)信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)骨組織與植入體之間的骨性鍵合。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是目前公認(rèn)的有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)成骨分化的的局部生長(zhǎng)因子，其高效的成骨活性已被充分認(rèn)可[6-8]。蛋白質(zhì)的固載方式分為：非共價(jià)固載[9-11]和共價(jià)固載[12]。非共價(jià)固載蛋白質(zhì)的量有限、停留時(shí)間短、易發(fā)生突釋；共價(jià)固載蛋白質(zhì)條件苛刻、操作復(fù)雜、反應(yīng)條件較劇烈。要實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效固載，需要瞬間固定，且需要一定的時(shí)間與周圍細(xì)胞發(fā)生作用使誘導(dǎo)活性得到充分發(fā)揮。采用靜電噴涂（ES）法制備材料的周期短、條件溫和、涂層厚度可控，該方法可以把BMP 快速、穩(wěn)定固載于金屬表面[13]，但需要均一、穩(wěn)定的導(dǎo)電溶液。殼聚糖（CS）是一種天然高分子多糖，具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，是固載蛋白質(zhì)良好的載體[14]，其氨基質(zhì)子化（NH2與H+結(jié)合）形成NH3+結(jié)構(gòu)，使得CS 溶液帶正電。

在鈦金屬表面構(gòu)建微米/亞微米級(jí)的結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞早期黏附，促進(jìn)成骨[15]。噴砂酸蝕（SLA）可構(gòu)建微米級(jí)別的形貌，改善表面粗糙度，增加比表面積。植入活性親水的鈦金屬材料更有利于細(xì)胞黏附、增殖，加速骨結(jié)合[16]。阿侖膦酸鈉（ALN）分子結(jié)構(gòu)中有大量的親水性基團(tuán)，物理吸附可以明顯改善材料表面的親水性，抑制破骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)[17]。本文首先將工業(yè)純鈦片（Ti）通過(guò)SLA 處理制得SLA-Ti，然后SLA-Ti 物理吸附ALN 進(jìn)行親水性處理制得ALN-SLA-Ti，最后采用靜電噴涂法將CS 與蛋白質(zhì)的混合溶液快速、穩(wěn)定地噴涂于ALN-SLA-Ti 表面制得CS 涂層。通過(guò)掃描電子顯微鏡表征各鈦片的表面形貌，選用小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）與鈦片共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)鈦片改性后的表面對(duì)細(xì)胞黏附、增殖與成骨分化能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

Ti：TA2 型，威高集團(tuán)；CS：η＞400 mPa·s 上海阿拉丁生化科技有限公司；ALN：分析純，上海泰坦科技有限公司；冰乙酸：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）：生化級(jí)，上海瑞邦有限公司；四唑鹽（MTT）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、二甲基亞砜（DMSO）：生化級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；C2C12 細(xì)胞：美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；rBMSCs：本實(shí)驗(yàn)室自行提取，上海斯萊克公司；牛血清白蛋白（BSA）、堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器

美國(guó)KDS 公司100 型恒流注射泵；日本日立公司S-4800 型掃描電子顯微鏡；上海中晨數(shù)字設(shè)備JC2000D2型水接觸角測(cè)量?jī)x；美國(guó)Molecular Devices 公司SPECTRAmax 384 型酶標(biāo)儀；日本Nikon 公司A1R 型共聚焦激光掃描顯微鏡。

1.3 SLA-Ti 的表面處理

用超純水配制質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL 的ALN 溶液，然后用0.22 μm 過(guò)濾膜無(wú)菌過(guò)濾該溶液，SLA-Ti 在過(guò)濾后的ALN 溶液中4 ℃浸泡2 h，浸泡后的SLA-Ti 在無(wú)菌超凈臺(tái)通風(fēng)干燥約15 min，干燥后的鈦片標(biāo)記為ALN-SLA-Ti。

1.4 涂層制備

用超純水配制w=0.5%的醋酸溶液，稱取60 mg CS 溶解于4 mL 的醋酸溶液中，制備w=1.5%的CS 溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求再加入BSA 或rhBMP-2 制備成CS 和蛋白質(zhì)的混合溶液。將微流注射器置于鈦片正上方，在靜電場(chǎng)作用下噴涂一定時(shí)間制得涂層。噴涂工藝參數(shù)：噴涂速率為0.3 mL/h，正電壓為10～11 kV，不銹鋼針頭與鈦片表面的距離為20～30 mm。當(dāng)噴涂時(shí)間分別為3、5、10 min 時(shí)，噴涂后的SLA-Ti 分別標(biāo)記為SLATi-3、SLA-Ti-5、SLA-Ti-10，噴涂后的ALN-SLA-Ti 分別標(biāo)記為ALN-SLA-Ti-3、ALN-SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-10，其制備示意圖如圖1 所示。

圖 1 鈦片表面可降解生物涂層的構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram of constructing degradable bio-coating on titanium surface

1.5 蛋白質(zhì)的體外釋放研究

1.5.1 固載方式對(duì)BSA 體外釋放的影響 分別配制BSA 溶液、BSA-CS 混合溶液，其中BSA 的質(zhì)量濃度為30 mg/mL，通過(guò)物理吸附BSA 溶液（方式A）、蛋白滴加BSA 溶液（方式B）、蛋白滴加BSA-CS 混合溶液（方式C）、靜電噴涂BSA-CS 混合溶液（方式D）、靜電噴涂后凍干BSA-CS 混合溶液（方式E）固載BSA 于ALNSLA-Ti 表面，處理時(shí)間為5 min，研究BSA 的體外釋放情況。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定每孔的光學(xué)密度（OD），根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)釋放量。

1.5.2 噴涂時(shí)間對(duì)BSA 體外釋放的影響 配制BSA-CS 混合溶液，其中BSA 的質(zhì)量濃度為30 mg/mL，在ALN-SLA-Ti 表面采用靜電噴涂的方式分別噴涂3、5、10 min 固載BSA，研究BSA 的體外釋放情況。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定每孔的OD 值，根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)釋放量。

1.6 生物學(xué)行為評(píng)價(jià)

1.6.1 細(xì)胞黏附與增殖 將Ti、SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、ALN-SLA-Ti-5（固載約2 μg rhBMP-2）分別與1 mL 懸浮液（約含20 000 個(gè)C2C12 細(xì)胞）在24 孔板中培養(yǎng)12 h 后，對(duì)孔板中的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色、表面黏附形態(tài)觀察。將Ti、SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5（固載約2 μg rhBMP-2）分別與1 mL 細(xì)胞懸浮液（約含20 000 個(gè)C2C12 細(xì)胞）在24 孔板中共培養(yǎng) 1、3 d，加入100 μL MTT 溶液，在37 ℃下孵育4 h；吸去多余溶液，加入500 μL DMSO，在37 ℃恒溫震蕩15 min；藍(lán)紫結(jié)晶物溶解后，從24 孔板中取200 μL 溶液加入96 孔板中，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492 nm 下測(cè)定每孔的OD 值。

1.6.2 ALP 活性檢測(cè) 采用ALP 活性法對(duì)各鈦片表面細(xì)胞的成骨分化能力進(jìn)行測(cè)試。將Ti、SLA-Ti、ALNSLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5（固載約2 μg rhBMP-2）與1 mL 懸浮液（含30 000 個(gè)rBMSCs 細(xì)胞）在24 孔板中共培養(yǎng)4、7、14 d，每隔3 d 換1 次培養(yǎng)液。共培養(yǎng)結(jié)束后，吸去多余溶液，PBS 清洗2 次，每孔加500 μL裂解液，37 ℃恒溫震蕩90 min；每孔取10 μL 溶液，孵育30 min 后，在波長(zhǎng)562 nm 下測(cè)定每孔的OD 值；從24 孔板中取50 μL 溶液至96 孔板后，再加100 μL 的ALP 工作液孵育2 h，在波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定每孔的OD值，進(jìn)而計(jì)算鈦片表面的ALP 的活性值。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈦片的表面形貌

圖2（a1～a3）展示了SLA-Ti 噴涂不同時(shí)間的表面形貌。SLA-Ti-3 表面只保留少許孔洞結(jié)構(gòu)，0.2～4 μm的孔洞微結(jié)構(gòu)基本被覆蓋；隨著噴涂時(shí)間增加，SLA-Ti 表面結(jié)構(gòu)被涂層完全覆蓋，基本為平面形貌。圖2（a4～a6）展示了ALN-SLA-Ti 噴涂不同時(shí)間的表面形貌，ALN-SLA-Ti-3 表面留有較多孔洞結(jié)構(gòu)；ALNSLA-Ti-5 表面形成直徑約5 μm 的微球涂層，且該表面仍有孔洞結(jié)構(gòu)，增加了鈦片表面粗糙度和比表面積，為后期細(xì)胞的黏附和增殖提供了有利的條件；ALN-SLA-Ti-10 表面覆蓋了微球和孔洞結(jié)構(gòu)，鈦片表面不均勻。

圖 2 SLA-Ti（上）與ALN-SLA-Ti（下）噴涂不同時(shí)間的表面形貌Fig. 2 Surface morphology of SLA-Ti （up） and ALN-SLA-Ti （down） after spraying differen time

2.2 鈦片表面的親疏水性

表1 比較了不同鈦片表面的接觸角。SLATi 表面接觸角約為101°，其表面疏水；ALN-SLATi 表面接觸角約為16°，親水性顯著增加。在SLATi 表 面 噴 涂3、5、10 min 時(shí)，接 觸角 分 別 約 為107°、100°、97°，CS 涂層的厚度并不能明顯改善SLA-Ti 表面的親疏水性。在ALN-SLA-Ti 表面噴涂3、5、10 min 時(shí)，接觸角分別約為 37°、59°、87°，接觸角隨著涂層厚度增加而逐漸增大。已有研究表明材料表面的親疏水性對(duì)細(xì)胞的黏附有很大影響，當(dāng)接觸角在 30°～70°時(shí)更有利于細(xì)胞黏附[18]。因此，ALN-SLA-Ti-5 的親水性表面為后期細(xì)胞的黏附提供了有利的條件。

表 1 不同鈦片表面的接觸角Table 1 Contact angles of different titanium surfaces

2.3 蛋白質(zhì)的控釋行為

圖3（a）比較了不同固載方式對(duì)蛋白質(zhì)釋放行為的影響。通過(guò)方式A 固載BSA 時(shí)，BSA 的突釋量約69%，突釋現(xiàn)象最為嚴(yán)重，12 h 內(nèi)幾乎完全釋放。通過(guò)方式B 固載BSA 時(shí)，BSA 的突釋量約為56%，1 d 內(nèi)幾乎完全釋放。通過(guò)方式C 固載BSA 時(shí)，BSA 的突釋量約為43%，5 d 內(nèi)幾乎完全釋放。通過(guò)方式D 固載BSA 時(shí)，BSA 突釋量約為25%，7 d 后BSA 的釋放量約為81%；通過(guò)方式E 固載BSA 時(shí)，凍干前后BSA 釋放量相似。因此，CS 載體對(duì)蛋白質(zhì)的釋放起到一定的緩釋作用，凍干對(duì)蛋白質(zhì)的釋放行為沒(méi)有顯著影響。

圖3（b）比較了噴涂時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)釋放行為的影響。噴涂3 min 后，BSA 的突釋量約37%，鈦片表面涂層偏薄，釋放迅速，7 d 后BSA 的釋放量約為95%；噴涂5 min 后，BSA 的突釋量約26%；噴涂10 min 后，BSA 的突釋量約為16%。噴涂5、10 min 后的鈦片表面涂層較厚，減緩了BSA 的釋放速率，7 d 后其釋放量約為80%。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)噴涂時(shí)間可控制蛋白質(zhì)的釋放量。

2.4 涂層的降解行為

圖4 顯示了ALN-SLA-Ti-5 表面的降解情況。隨著降解時(shí)間的增加，鈦片表面構(gòu)建的CS 涂層逐漸降解。3 d 后，鈦片表面在一定程度上維持著微球形貌；7 d 后，鈦片表面剩余的涂層量較少，微球形貌基本消失；10 d 后，鈦片表面有少量的CS 涂層，仍具有一定的可降解性。因此，蛋白質(zhì)隨著CS 涂層的降解持續(xù)釋放，為后期細(xì)胞的黏附、增殖和早期成骨分化不斷提供生長(zhǎng)因子。

圖 3 固載方式（a）和噴涂時(shí)間（b）對(duì)鈦片表面蛋白質(zhì)釋放行為的影響Fig. 3 Effects of loading methods （a） and spraying time （b） on the released behavior of titanium surface

圖 4 CS 涂層在PBS 緩沖液中的降解行為Fig. 4 Degradation behavior of CS coatings in PBS buffer

2.5 細(xì)胞的黏附與增殖

圖 5 C2C12 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)12 h 后的黏附形態(tài)Fig. 5 Adhesion morphology of C2C12 cells after co-culture on the surface of titanium for 12 h

圖5 比較了C2C12 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)12 h后的黏附形態(tài)。SLA-Ti 表面黏附的細(xì)胞數(shù)量明顯多于Ti 表面黏附的細(xì)胞數(shù)量；ALN-SLA-Ti 表面黏附的細(xì)胞數(shù)量略多于SLA-Ti 表面黏附的細(xì)胞數(shù)量；ALN-SLATi-5 表面黏附的細(xì)胞數(shù)量最多。圖6（a）比較了C2C12 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)1、3 d 后的增殖情況。共培養(yǎng)1 d 后，SLA-Ti、ALN-SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti-5 表面細(xì)胞的活性略高于Ti 表面細(xì)胞的活性。共培養(yǎng)3 d后，前述樣品表面細(xì)胞的活性明顯高于Ti 表面細(xì)胞的活性，其中ALN-SLA-Ti-5 表面細(xì)胞的增殖效果最明顯。

2.6 鈦片表面的成骨分化能力

圖6（b）比較了rBMSCs 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)1、7、14 d 后的成骨分化情況。共培養(yǎng)1 d 后，5 組鈦片表面細(xì)胞的ALP 活性沒(méi)有顯著差異，因?yàn)榧?xì)胞與鈦片共培養(yǎng)時(shí)間短，細(xì)胞還處于黏附增殖期，rhBMP-2 對(duì)細(xì)胞的促成骨分化能力較弱。共培養(yǎng)7 d 后，SLA-Ti、SLA-Ti-5、ALN-SLA-Ti 表面細(xì)胞的ALP 活性略高于Ti 表面細(xì)胞的ALP 活性，ALN-SLA-Ti-5 表面細(xì)胞的ALP 活性最高，成骨分化能力明顯。共培養(yǎng)14 d 后，Ti、SLA-Ti、SLA-Ti-5 表面細(xì)胞的ALP 活性變化較小，而ALN-SLA-Ti 表面細(xì)胞的ALP 活性略有增加，ALNSLA-Ti-5 表面細(xì)胞的ALP 活性最高，成骨分化能力明顯。

圖 6 C2C12 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)1、3 d 后的增殖行為（a）；rBMSCs 細(xì)胞在鈦片表面共培養(yǎng)1、7、14 d 時(shí)的ALP 活性（b）Fig. 6 Proliferation of C2C12 cells after co-culture on the surface of titanium for 1 d and 3 d (a); ALP activity of rBMSCs cells on the surfaces of titanium for 7 d and 14 d (b)

3 結(jié) 論

（1）ALN-SLA-Ti-5 表面形成直徑約5 μm 的微球涂層，并保留了SLA-Ti 表面的孔洞結(jié)構(gòu)，為后期細(xì)胞的黏附、增殖提供了有利的條件。

（2）通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)固載方式、噴涂時(shí)間可調(diào)控蛋白質(zhì)的載入量；隨著CS 涂層降解，蛋白質(zhì)可實(shí)現(xiàn)持續(xù)、高效的釋放，緩解了突釋現(xiàn)象。

（3）固載rhBMP-2 的ALN-SLA-Ti-5 表面更有利于細(xì)胞的黏附和增殖，促進(jìn)細(xì)胞早期成骨分化。