李 婕， 黃 平， 王 琮， 楊少玲， 周永豐

（1. 上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，金屬基復(fù)合材料國家重點實驗室，上海 200240；2. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海 201499）

超聲成像[1-2]由于其無創(chuàng)性、低輻射、實時監(jiān)測以及經(jīng)濟(jì)實惠的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于器官、肌肉或者血流體系的檢查診斷中。超聲造影劑（UCA）[3]作為一種可以顯著增強(qiáng)超聲信號的試劑對于輔助超聲成像進(jìn)行精準(zhǔn)診斷具有重要的意義。典型的UCA 是一種由不同種類的殼材料包裹氣體形成的微氣泡，氣體是一種很強(qiáng)的聲波散射體，所以導(dǎo)致UCA 與周圍組織的聲阻抗值差異很大，表現(xiàn)在圖像上為超聲波回聲信號的增強(qiáng)，圖像對比度的增加。UCA 在器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)的顯影成像和血流動力學(xué)的評估等領(lǐng)域[4]廣泛應(yīng)用，如心腔中心內(nèi)膜邊緣的增強(qiáng)成像[5]、心肌組織血流灌注的實時顯示[6]以及新生微血管生成的檢測診斷[7]等。

腫瘤組織在生長期間需要大量的新生血管來為快速分裂的細(xì)胞提供營養(yǎng)，腫瘤血管和正常血管的差異在于其血管內(nèi)皮間隙會擴(kuò)張增大，在血管壁上形成380～780 nm 的小孔[8]。常規(guī)的UCA 尺寸一般為微米級（2～8 μm），例如臨床上最常用的造影劑Sonovue，由于尺寸的限制，其不能滲透腫瘤組織的脈管系統(tǒng)到達(dá)相應(yīng)的靶點發(fā)揮診斷或治療的功效。因此，開發(fā)出一種可以滲透到腫瘤組織血管間隙的納米級UCA 具有十分重要的意義。近年來人們開發(fā)出了一系列不同種類的納米級UCA，并將其應(yīng)用于腫瘤組織的成像和治療中[9-12]，其中基于磷脂分子的納米級UCA 因其較好的造影性能和良好的生物相容性得到了廣泛應(yīng)用。Yin等[9]使用薄膜水化-聲振空化法、通過離心后處理得到了尺寸為（381.7 ± 36.9） nm的納米級磷脂UCA，并將其作為載體負(fù)載藥物分子到達(dá)腫瘤部位，結(jié)合低頻超聲有效地抑制了腫瘤的生長。Zhou 等[10]使用薄膜水化-機(jī)械振蕩法制備了磷脂UCA 微泡，靜置分離得到了尺寸為（635.5 ± 25.4） nm 的納米級造影劑，并將其運(yùn)用到腫瘤靶向診斷中。然而，大多數(shù)基于磷脂小分子制備的UCA 尺寸分布由微米級到納米級不等，需要通過重力作用[10]、離心[8,9,13]、過濾[14]等方法來梯度分離大尺寸的微米級氣泡和小尺寸的納米級氣泡，步驟復(fù)雜，產(chǎn)率較低。此外，由于受限于小分子特性，磷脂類UCA 的穩(wěn)定性不佳，難以滿足需求。因此，迫切需要開發(fā)出一類制備簡單、穩(wěn)定性好、造影性能優(yōu)良的納米級UCA。

超支化聚合物具有優(yōu)異的自組裝行為，可以形成包括管、囊泡在內(nèi)的多種形態(tài)的組裝體[15-17]，且組裝形貌易于調(diào)控。超支化聚合物因其組裝形貌多樣化、官能團(tuán)豐富易修飾等優(yōu)點在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[18]，如藥物輸送[19]、生物成像[20,21]、基因轉(zhuǎn)染[22]等。本文使用以超支化聚3-乙基-3-羥甲基環(huán)氧丁烷（HBPO）為疏水核，聚乙二醇（PEO）為親水性鏈段的雙親性超支化聚醚（HSP）作為殼材料制備了一系列UCA。HSP 由疏水的超支化聚醚核HBPO 和親水的PEO 臂組成。本文利用HBPO 核的疏水作用，制備了內(nèi)部填充六氟化硫（SF6）氣體，外部包裹著HSP 的超聲造影劑（HSP-UCA）。通過改變PEO 鏈段的長度，HSP 可以在水中組裝成尺寸從100 nm 到100 μm 不等的囊泡[18]，因此同樣地可以通過改變PEO 鏈段長度來控制HSP-UCA 的尺寸。當(dāng)PEO 的臂長為10 時，HSP-UCA 尺寸為517.3 nm，造影劑懸液中SF6體積分?jǐn)?shù)為9.12 × 10-3，體外超聲半衰期為3～5 min，且穩(wěn)定性和濃度都較高。所得的納米級HSP10-UCA 經(jīng)兔耳緣靜脈注射后可在心臟內(nèi)觀察到較好的灌注效果，表明其具有良好的造影效果。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

三羥甲基丙烷（TMP）：純度99%，北京百靈威科技有限公司；碳酸二乙酯（DEC）：純度99%，Adamas 試劑公司；三氟化硼乙醚絡(luò)合物（BF3·OEt2）：w（BF3） = 48%，Adamas 試劑公司；碳酸鉀（K2CO3）：純度＞99%，Greagent 試劑公司；環(huán)氧乙烷（EO）：純度＞99%，Adamas 試劑公司；六氟化硫（SF6）氣體：純度99.9%，上海偉創(chuàng)標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司；無水乙醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑均購自國藥化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖液（PBS）：購自生工生物工程（上海）股份有限公司（pH 7.4）。沒有特別說明的生物化學(xué)品，未經(jīng)處理直接使用。

1.2 測試與表征

核磁共振波譜儀（德國布魯克公司AVANCE Ⅲ HD 型400MHz）：取10 mg 樣品溶于0.5 mL 氘代二甲基亞砜（DMSO）中進(jìn)行一維氫譜測試；透射電子顯微鏡（美國FEI 公司Talos F200X 型）：用移液槍取10 μL 造影劑溶液（0.5 mg/mL）滴于銅網(wǎng)上，室溫下自然干燥后進(jìn)行測試；凝膠滲透色譜儀（日本東曹株式會社HLC-8320GPC 型）：取10 mg 樣品溶于2 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中測試，以DMF 為流動相，流速為0.6 mL/min，標(biāo)樣為PEO；動態(tài)光散射儀（英國 Malvern 公司ZS90 型）。

1.3 HSP 的合成

HSP 的合成參考文獻(xiàn)[15, 23]。首先在500 mL 三頸燒瓶中裝上恒壓滴液漏斗，加料前反復(fù)抽真空和通氮氣，明火烘烤以除盡水分和空氣。然后將3-乙基-3 羥甲基環(huán)氧丁烷（EHO）單體（11.6 mL, 0.1 mol）置于恒壓滴液漏斗中，將約100 mL 干燥的CH2Cl2通過膠管連接口注射到燒瓶中，待反應(yīng)體系溫度降到0 ℃后，將6.4 mL BF3·OEt2（0.05 mol）注射到溶液中，然后快速滴加EHO 單體。在0 ℃以下，強(qiáng)烈攪拌下反應(yīng)24 h。隨后將1 mol EO 單體加入到恒壓漏斗中，并快速滴加到上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)反應(yīng)24 h 后加入水終止反應(yīng)，粗產(chǎn)物采用正己烷沉淀后再用水透析，冷凍干燥后得到無色黏稠狀HSP。通過控制EO 的量（0.3，0.5，1.0 mol）分別合成了PEO 臂長為3，5，10 的HSP，分別命名為HSP3、HSP5、HSP10。

1.4 HSP-UCA 的制備

采用聲振空化法，首先取200 mg 不同臂長的HSP 加入到10 mL PBS 中，攪拌使其溶解自組裝形成雙分子層，在向溶液中通入2 min 的SF6氣體（10 mL/min）后，邊使用超聲破碎儀施加強(qiáng)超聲邊通入SF6氣體，在強(qiáng)超聲作用下水中會形成較多的負(fù)壓核，SF6氣體會在這個過程中被包裹到其中，此時氣液界面存在著很強(qiáng)的界面張力，雙親性大分子HSP 解離擴(kuò)散到氣液界面來穩(wěn)定氣液界面，形成由超支化聚合物包裹SF6氣體的單層氣泡。使用超聲破碎儀以最大輸出功率超聲3 min，得到乳白色HSP-UCA 懸液，靜置后上層為不穩(wěn)定氣泡，下層為HSP-UCA。其中，HSP10-UCA 的尺寸為517.3 nm。本文主要針對HSP10-UCA 進(jìn)行性能及超聲成像研究。

1.5 GC-MS 定性定量測定HSP10-UCA 中SF6 的氣體體積分?jǐn)?shù)

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS，美國Agilent 7890A-5975C 型)來定性、定量測定HSP10-UCA 懸液中SF6氣體濃度。選用GC-MS 的選擇離子監(jiān)測模式（SIM）測定微泡中氣體的成分，通過繪制SF6氣體標(biāo)準(zhǔn)曲線測定微泡懸液中SF6的體積分?jǐn)?shù)。首先采用N2作為稀釋氣體配制一系列體積分?jǐn)?shù)梯度的SF6標(biāo)準(zhǔn)氣體（5 ×10-3，10 × 10-3，20 × 10-3，30 × 10-3，100 × 10-3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取1 mL 待測微泡樣品加入到20 mL 頂空瓶中，超聲處理30 min 后加熱至70 ℃，保持3 h 使微泡破裂完全釋放出SF6氣體后，吸取一定體積的氣體進(jìn)樣，根據(jù)流出曲線峰面積計算得到SF6氣體的體積分?jǐn)?shù)。

1.6 HSP10-UCA 體外超聲成像效果評價

使用多模式小動物超聲/光聲成像系統(tǒng)（美國Fujifilm VisualSonics VEVO LAZR-X 型）進(jìn)行納米級HSP10-UCA 體外超聲成像測試，采集MX550S 探頭在B 模式下的圖像，頻率為40 MHz，增益值為30 dB。首先將脫氣水加入到立方體水槽中，將超聲探頭浸沒于液面下捕獲圖像作為空白對照。隨后將HSP10-UCA 依次加入加到水槽中，按照同樣的方法捕獲圖像，每個樣品至少采集3 張圖片，為了觀察樣品體外超聲穩(wěn)定性，本文采集了其在連續(xù)的超聲輻照下不同時間點（0，3，5，10，20，30 min）的超聲圖像。

1.7 HSP10-UCA 體內(nèi)超聲成像效果評價

納米級HSP10-UCA 體內(nèi)超聲成像測試使用超聲成像儀（美國GE VividE9 型）的9L 探頭進(jìn)行，超聲探頭頻率為3 MHz，機(jī)械指數(shù)MI = 0.15，在Contrast 模式下進(jìn)行圖像采集，所有的圖像采集均采用如上相同的參數(shù)。選用新西蘭大白兔（約2.5 kg）為實驗動物模型，用w = 10%的水合氯醛麻醉劑（3～3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉兔子后固定在兔床上，剃去心臟部位的兔毛后通過耳緣靜脈建立外周靜脈通道。首先對沒有注射HSP10-UCA 之前的兔心臟進(jìn)行超聲檢查，記錄初始狀態(tài)的空白圖像，接著注射1 mL HSP10-UCA 懸浮液并立即用1 mL生理鹽水沖洗試管，觀察HSP10-UCA 在心臟內(nèi)的灌注情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同PEO 臂長的HSP 的合成及表征

超支化聚醚HSP 的合成路線如圖1 所示，通過兩步陽離子開環(huán)聚合得到了HSP。圖2 是HSP 的1H-NMR譜圖，從圖中可以看出，化學(xué)位移在0.8 處的峰（峰a）對應(yīng)于HBPO 核中―CH2―CH3中甲基的質(zhì)子峰，1.3 處的峰（峰b）對應(yīng)于HBPO 核中―CH2―CH3中亞甲基的質(zhì)子峰，3.1 處的峰（峰c）對應(yīng)于HBPO 核主鏈中―CH2―O―CH2-亞甲基的質(zhì)子峰，3.4（峰d）處的峰對應(yīng)于HBPO 核中―CH2―OH 中亞甲基的質(zhì)子峰，3.5～3.8 的峰（峰e, f, g）對應(yīng)于PEO 親水段中和醚氧相連的―O―CH2―上亞甲基的質(zhì)子峰。通過PEO 鏈段中亞甲基峰的峰面積和HBPO 中甲基峰面積的比值計算得到超支化聚合物的臂長（RA/C），根據(jù)文獻(xiàn)[15]計算得到圖2 中HSP 共聚物樣品的RA/C= 10。通過改變EO 的加入量可得到不同RA/C的HSP 樣品，所得結(jié)果列于表1 中。

圖 1 超支化聚醚HSP 的合成路線Fig. 1 Synthetic route of hyperbranched polyether

圖 2 HSP 的1H-NMR 譜圖Fig. 2 1H-NMR spectrum of HSP

表 1 HSP 樣品的表征Table 1 Characterizations of HSP samples

2.2 HSP-UCA 體外造影效果評價

圖3 為純水和不同PEO 臂長的HSP-UCA 的體外超聲造影圖。從圖中可以看出隨著PEO 臂長的增長，HSP-UCA 造影劑濃度逐漸增加。HSP3-UCA 造影劑濃度較低，視野中只可見到為數(shù)不多的造影劑，說明該造影劑穩(wěn)定性較差。HSP10-UCA 造影劑濃度最高，視野中可見密集的造影劑，穩(wěn)定性較好。推測臂長對造影劑穩(wěn)定性的影響和對囊泡穩(wěn)定性影響相似，PEO 親水鏈段越長，其在水中形成的水合層越致密，造影劑在水中的穩(wěn)定性也越好。

2.3 HSP10-UCA 粒徑、形貌的表征

圖 3 HSP-UCA 的體外超聲造影圖Fig. 3 in vitro Ultrasound images of HSP-UCA

圖 4 HSP10-UCA 的宏觀照片（a），DLS 曲線（b）和TEM 圖（c，d）Fig. 4 Photos (a), DLS curve (b) and TEM images (c, d) of HSP10-UCA

圖4 為HSP10-UCA 的宏觀照片，DLS 曲線和TEM 圖。如圖4（a）所示，微泡懸液為乳白色，靜置后上層為不穩(wěn)定氣泡，下層為納米級造影劑。DLS 測定出該造影劑的平均粒徑為517.3 nm，如圖4（b）所示，與圖4（c，d）的TEM 結(jié)果相吻合，從TEM 圖中可以看出造影劑的粒徑均在500 nm 左右，證明本文成功地制備了納米級HSP10-UCA。

2.4 HSP10-UCA 的體外造影效果評價

圖5 為HSP10-UCA 的體外造影效果隨時間衰減的圖像。由于造影效果和造影劑的粒徑成正比，所以從圖中可以看到相較于一般的微米級UCA，納米級HSP10-UCA 體外造影圖像的超聲信號強(qiáng)度要稍微弱一些。當(dāng)體外超聲時間為3 min 時，還有較多肉眼可見的造影劑存在；當(dāng)超聲時間達(dá)到5 min 時，造影劑數(shù)量大幅減少，由此可推測體外造影的半衰期大約為3～5 min；當(dāng)體外超聲時間達(dá)到30 min 時，造影劑幾乎全部破裂。

圖 5 HSP10-UCA 體外造影的時間衰減圖像Fig. 5 in vitro Ultrasound images of HSP10-UCA for different durations

2.5 HSP10-UCA 的體內(nèi)造影效果評價

圖6 為HSP10-UCA 在兔心臟內(nèi)的超聲造影圖。從圖6（a）可見，在注射HSP10-UCA 之前，心臟內(nèi)部的回聲信號值很低，其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)也無法通過超聲成像觀察到，當(dāng)靜脈注射HSP10-UCA 納米級超聲造影劑之后，心臟迅速得到了灌注，可見其內(nèi)部的房室結(jié)構(gòu)，平均造影時長為50～60 s，表明HSP10-UCA 具備一定的體內(nèi)造影成像的能力。使用GC-MS 測定了造影劑中SF6氣體濃度，SIM 模式下可捕獲樣品較強(qiáng)的吸收峰，表明了造影劑中包覆了一定量的SF6氣體，將峰面積代入SF6標(biāo)準(zhǔn)曲線（y = 153 942.111 87x - 1.13 × 106，R2=0.994 46）中，計算得到造影劑懸液中SF6氣體的體積分?jǐn)?shù)為9.12 × 10-3。

圖 6 兔心臟在注射HSP10-UCA 納米級超聲造影劑之前（a）和之后（b）的超聲圖像Fig. 6 in vivo Ultrasound images of rabbit heart before (a) and after (b) HSP10-UCA injection

3 結(jié) 論

（1）合成了不同PEO 臂長的超支化聚合物HSP，隨著PEO 鏈的增長，造影劑的穩(wěn)定性逐漸增加，濃度也逐漸增加。

（2）HSP10-UCA 平均粒徑為517.3 nm，SF6氣體的體積分?jǐn)?shù)9.12 × 10-3，其體外超聲造影半衰期為3～5 min，兔心臟超聲造影平均造影時間50～60 s，組織灌注效果良好。