田麗貞，韓潤焜，田麗如

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最常見的組織類型。ESCC是致死率最高的消化道腫瘤及全球死亡率第六高的腫瘤[1]。其單獨手術(shù)治療的5年生存率不足20%[2]。早期食管癌病灶局限，臨床癥狀不明顯，不易發(fā)現(xiàn)。臨床表現(xiàn)僅為輕微梗噎感、胸骨后輕度燒灼等非特異性癥狀。鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)等血清標(biāo)志物已廣泛用于ESCC的篩查，然而單一血清腫瘤標(biāo)記物檢測特異性不高，目前尚無一種特異性、敏感性較好的診斷指標(biāo)[3]。近年來，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究利用GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，尋找潛在的腫瘤標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)許多有價值的腫瘤標(biāo)志物。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫上ESCC相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找差異的指標(biāo)，并通過在線基因表達(dá)譜分析(GEPIA)工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)工具驗證其在食管癌組織中的表達(dá)情況，隨后檢測其在血清中的含量，探討其作為食管癌診斷標(biāo)志物的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1月—2018年10月中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理確診的ESCC患者109例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①受檢前均未接受放、化療和手術(shù)治療；②無肝、腎、心、肺等嚴(yán)重器質(zhì)性疾患，無腫瘤家族史。其中男69例，年齡(41～70)58.1歲；女40例，年齡(49～67)59.9歲。收集廣州市戒毒管理局醫(yī)院配對的健康人體檢樣本110例做為對照組，男70例，年齡(40～70)58.3歲；女40例，年齡(45～70)59.7歲；體檢未發(fā)現(xiàn)明顯異常及無腫瘤家族史。食管癌組和對照組性別、年齡構(gòu)成比比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表1)。

表1 臨床樣本的特征資料

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫差異mRNA的篩選 選用“ESCC”和“mRNA”字段在GEO數(shù)據(jù)庫上篩選ESCC數(shù)據(jù)集，隨后選取GEO數(shù)據(jù)庫(GSE38129)進(jìn)行差異分析，在微陣列數(shù)據(jù)分析(limma)R包的線性模型中，利用經(jīng)驗bayes(ebayes)方法比較癌和癌旁組織(adjacent normal tissue)之間的表達(dá)，提取mRNA，應(yīng)用benjamini-hochberg錯誤發(fā)現(xiàn)率方法調(diào)整原始P值。對于與多個探針相關(guān)的基因，將其分配給在其表達(dá)譜上變異最顯著的探針。選擇調(diào)整后的P值(adj.P值)<0.05和log2 foldchange>1.5作為候選指標(biāo)。

1.3 GEPIA差異基因驗證 為了驗證篩選基因MMP1在食管癌中的表達(dá)水平，本研究使用GEPIA對食管癌組織和癌旁組織中差異基因的表達(dá)進(jìn)行比較。MMP1表達(dá)差異用箱型圖表示。

1.4 血清樣本檢測 一次性真空采血管抽取空腹靜脈血3 mL送檢，離心分離血清。

血清CYFRA21-1、CEA測定采用電化學(xué)發(fā)光法(上海羅氏公司電化學(xué)發(fā)光儀E602及其配套試劑)，參考范圍分別為0.3～3.3 ng/mL、0～5.00 ng/mL。血清SCC測定采用化學(xué)發(fā)光法(雅培公司化學(xué)發(fā)光儀I2000及其配套試劑，美國)，參考范圍為0～1.5 ng/mL。血清MMP1測定采用武漢華美生物公司生產(chǎn)的血清基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1)ELISA試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 MMP1在ESCC癌組織和癌旁組織差異表達(dá)對GEO數(shù)據(jù)庫(GSE38129)的30例食管癌組織和30例癌旁組織進(jìn)行mRNA差異分析，共發(fā)現(xiàn)108個基因在食管癌組織和癌旁組織表達(dá)差異明顯(圖1)，其中MMP1的差異最為明顯(logFC=4.849,P=7.90E-12)。

T：癌組織，N：癌旁組織

2.2 MMP1表達(dá)在GEPIA工具的驗證 MMP1在182例食管癌組織的表達(dá)明顯高于286例癌旁組織(P<0.05，圖2)。隨后182例患者根據(jù)MMP1水平的高低分為高水平組(n=91)和低水平組(n=91)，總體生存分析(OS)顯示HR=0.82,P=0.4,；疾病無進(jìn)展生存(DFS)分析HR=0.92,P=0.73(圖3)。

圖2 MMP1在182例食管癌組織和286例癌旁組織表達(dá)情況

A.OS生存曲線圖

2.3 食管癌組與對照組CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1濃度的比較 食管癌組患者血清CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1濃度均明顯高于對照組(P<0.05，表2)。

表2 食管癌組與對照組CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1濃度的比較

2.4 ESCC不同分期CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1水平比較 CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1四種標(biāo)志物血清表達(dá)水平在早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者顯著低于晚期(Ⅲ～Ⅳ期)患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表3)。

表3 外周血CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1濃度與食管癌臨床分期的關(guān)系

2.5 ROC曲線分析CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1單獨及聯(lián)合檢測在ESCC的診斷效能 對110例正常對照和109例ESCC患者繪制CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1單獨的ROC曲線，MMP1的AUC是0.874；CEA,CYFRA21-1和SCC的AUC分別是0.66、0.735和0.788。4項獨立指標(biāo)中MMP1的曲線下面積最大。為了繼續(xù)提高診斷的精度，本研究將4項指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合，研究聯(lián)合檢測在ESCC的診斷作用。MMP1和SCC聯(lián)合的診斷效能最佳，高于傳統(tǒng)指標(biāo)CEA,CYFRA21-1和SCC 3者的聯(lián)合。

表4 在ESCC中單項和聯(lián)合的診斷效能

3 討論

食管癌的主要病理類型為腺癌(esophageal adenocarcinomas，EAC)和ESCC兩種。ESCC主要分布在亞洲、非洲及南美洲地區(qū)，而EAC主要在歐洲較為常見[1]。目前，臨床上常用于食管癌診斷及預(yù)后的標(biāo)志物主要是CEA、CYFRA21-1和SCC[4]。CEA是臨床常用的廣譜腫瘤標(biāo)志物，其升高可見于胃癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌等。CYFRA21-1是測量其最初作為肺鱗癌的標(biāo)志物，一般認(rèn)為其濃度升高見于鱗狀細(xì)胞腫瘤[5]。CYFRA21-1對ESCC、肺鱗癌、宮頸癌等的診斷具有重要參考價值。有文獻(xiàn)報道，CYFRA21-1可應(yīng)用于食管癌患者放化療的監(jiān)測[6-7]。SCC是鱗狀細(xì)胞抗原，其在食管癌的篩查中具有重要的作用。然而至今尚無一種理想的血清學(xué)腫瘤標(biāo)記物能單獨應(yīng)用于食管癌的診斷及預(yù)后判斷。

目前，基于系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的生物信息學(xué)計算方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥等復(fù)雜疾病的差異基因、蛋白、血清標(biāo)志物等的篩選。生物信息學(xué)方法具有便宜、省時，并且可以通過文獻(xiàn)挖掘、關(guān)聯(lián)分析和生物信息學(xué)功能豐富驗證。隨著越來越多的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)的獲取和積累，計算方法將為未來的精確醫(yī)學(xué)策略提供越來越強(qiáng)大的支持。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫上ESCC差異基因的分析，篩選出癌組織和癌旁表達(dá)差異明顯的基因(MMP1)，并采用GEPIA工具對MMP1在TCGA數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行驗證。

MMPs是一個鋅和鈣依賴的蛋白水解酶家族。目前人類已發(fā)現(xiàn)超過24個MMPs的膜錨定或分泌形式。它們被分為膠原酶、明膠酶、苦參素、基質(zhì)溶出素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶等。MMP1是一種膠原酶分泌蛋白，其中關(guān)鍵特性是它們能夠切割間質(zhì)膠原酶和許多其他細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)和非ecm分子。MMP1特異性降解成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2、3、5和轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白并釋放這些蛋白。在腫瘤發(fā)生過程中，MMPs通過細(xì)胞粘附力的喪失、細(xì)胞分裂的解除和細(xì)胞凋亡的逃避，介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移，影響腫瘤的發(fā)生和生長。研究顯示，MMP1的過表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，包括乳腺癌、頭頸部腫瘤、肺癌和腎癌等[8-12]。近期，Liu等[11]研究顯示MMP1的過表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。Chen等[12]的研究也顯示聯(lián)合檢測血清中MMP1在食管癌患者中顯著升高。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫上食管癌差異基因的分析，篩選出癌組織和癌旁組織表達(dá)差異明顯的基因(MMP1)，并采用GEPIA工具進(jìn)行驗證，最后評估血清中MMP1與傳統(tǒng)食管癌標(biāo)志物對ESCC的診斷價值。CYFRA21-1、SCC、CEA和MMP1四種腫瘤指標(biāo)水平在ESCC患者與正常人以及Ⅰ～Ⅱ與Ⅲ～Ⅳ期的之間有明顯差異。ROC分析顯示血清MMP1在ESCC的診斷精度優(yōu)于CEA、CYFRA21-1以及SCC。這與其他研究結(jié)果相符，CEA、CYFRA21-1和SCC展現(xiàn)出較低的靈敏度度，而特異性相對較高[4]。與傳統(tǒng)指標(biāo)相比，MMP1顯示出更高的靈密度和稍低的特異性。由于單一指標(biāo)對ESCC的靈敏度較低(CEA、CYFRA21-1、SCCA)，很多研究都強(qiáng)調(diào)聯(lián)合檢測[13-14]。在本研究中，MMP1聯(lián)合CEA(71.55%),CYFRA21-1(81.09%)或者SCC(82.13%)可以在不明顯減低特異性的情況下，分別將原有單一指標(biāo)的靈敏度(CEA：19.00%、CYFRA21-1：40.00%、SCC：30.90%)明顯提升。在早期患者中MMP1和SCC聯(lián)合的靈敏度最高，到達(dá)68.80%。因此，本研究中MMP1聯(lián)合SCC在ESCC診斷中是最優(yōu)的組合。

本研究不足之處：由于部分患者隨訪時間不足一年，未對血清MMP1的預(yù)后效能進(jìn)行評價。雖采用GEPIA工具進(jìn)行預(yù)后分析，但由于TCGA數(shù)據(jù)庫僅顯示ESCA(食管癌)的數(shù)據(jù)，并未區(qū)分ESCC，后續(xù)可對血清MMP的價值進(jìn)行大樣本驗證研究。

綜上所述，隨著食管癌臨床分期的提高，血清MMP1水平逐漸升高，提示可能對于判斷ESCC的病情分期、進(jìn)展及腫瘤的惡性程度均有幫助；血清MMP1聯(lián)合SCC檢測的診斷靈敏度和特異性最佳，可為ESCC的診斷提供參考。