張 千，朱亞寧，周武碧

食管癌是世界上最致命的上消化道癌癥之一[1]，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占90%以上[2]。盡管食管癌的診斷和治療取得了巨大的進(jìn)步，但患者預(yù)后仍然很差，5年生存率僅為20%[3]。因此，有必要對食管癌的致病機(jī)理進(jìn)行深入探究，為其提供新的治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNAs)是一種具有超過200個(gè)堿基對的非編碼類RNA，在人體的各種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究證實(shí)，lncRNAs參與了多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs與食管癌的進(jìn)展有關(guān)，如lncRNA UCA1[5]、PEG10[6]等。鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1(zinc finger antisense 1,ZFAS1)是新近發(fā)現(xiàn)位于染色體20q13的lncRNA，最初發(fā)現(xiàn)ZFAS1異常表達(dá)于乳腺癌組織和細(xì)胞中，隨后有研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，且與癌癥的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)，另外ZFAS1還被發(fā)現(xiàn)可在結(jié)腸癌中作為致癌基因發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用[7]。然而，目前罕有關(guān)于ZFAS1在食管癌作用的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA,miRNA)miR-302b-3p可能是ZFAS1的靶基因。有研究發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用[8]。因此，本研究假設(shè)lncRNA ZFAS1可通過靶向miR-302b-3p在食管癌中發(fā)揮作用。首先檢測食管癌組織和細(xì)胞的ZFAS1表達(dá)水平，并進(jìn)一步研究抑制ZFAS1表達(dá)對食管癌細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月—2017年6月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院行食管癌手術(shù)切除術(shù)的38例患者，收集ESSC和相應(yīng)癌旁組織(距離原發(fā)灶>5 cm)。本研究納入的患者在術(shù)前未接受過局部或全身治療。所有組織樣本經(jīng)液氮冷凍，儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱以供使用。本研究所有患者知情同意，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化的正常食管上皮細(xì)胞Het-1A及Eca-109細(xì)胞系均購自美國ATCC公司，分別使用含有10%胎牛血清(美國Gibco公司)和100 U/mL青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco′s modification of Eagle′s medium,DMEM，瑞士Lonza公司)及RPMI-1640(美國Invitrogen公司)的培養(yǎng)基培養(yǎng)于含5% CO2的37 ℃環(huán)境中。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測組織和細(xì)胞ZFAS1表達(dá) 使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織和細(xì)胞總RNA成分，分光光度計(jì)測得RNA濃度和OD260/280比值。根據(jù)說明書逆轉(zhuǎn)錄(日本Takara公司)獲得cDNA，隨后使用SYBR Green試劑盒(日本Takara公司)在ABI 7300 System PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上進(jìn)行qRT-PCR檢測。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，GAPDH和ZFAS1引物由中國生工公司代為設(shè)計(jì)與合成，序列如下：ZFAS1(前引物：5′-AAGCCACGTGCAGACATCTA-3′；后引物：5′-CTACTTCCAACACCCGCATT-3′)，GAPDH(前引物：5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′；后引物：5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′)。采用2?傆bΔΔCt法計(jì)算ZFAS1的相對表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將Eca-109細(xì)胞分為3組：空白組、NC干擾組及ZFAS1干擾組。將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待24 h后根據(jù)說明書，使用LipofectamineTM3 000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)進(jìn)行ZFAS1干擾RNA(ZFAS1-siRNA)、陰性對照(NC-siRNA)(廣州RiboBio公司)的轉(zhuǎn)染。6 h后更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Cell Counting Kit-8(CCK-8)測定細(xì)胞活性 使用CCK-8(日本Dojindo公司)測定細(xì)胞活性，首先將空白組、NC干擾組及ZFAS1干擾組3組細(xì)胞以1×104的密度均勻接種于96孔板中(每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔)，連續(xù)4 d相同時(shí)間測定細(xì)胞450 nm波長下的OD值以評估細(xì)胞活性。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 使用記號(hào)筆和尺子在6孔板背面適當(dāng)?shù)禺嫵鏊骄€，將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后使用移液槍頭垂直于先前畫的水平線畫3條互相平行的垂直線，隨后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗細(xì)胞3次，去除脫落細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。分別于0 h和48 h取標(biāo)本拍照進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 采用膜聯(lián)蛋白V(annexin-V)-異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)測定細(xì)胞凋亡水平。將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后按照說明書收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因 將Eca-109細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)，并將pmirGLO-ZFAS1-wt(野生型)或pmirGLO-ZFAS1-mut(突變型)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和miR-302b-3p模擬物(miR-302b-3p mimics)或miR-302b-3p抑制物(miR-302b-3p inhibitor)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western蛋白印跡法 利用RIPA強(qiáng)裂解液(上海碧云天公司)裂解提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白條帶，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Millipore公司)，封閉后進(jìn)行一抗c-Jun氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)和上皮細(xì)胞激酶(epithelial cell kinase 2,EphA2)(均購自美國Abcam公司，編號(hào)分別為ab178953、ab182408、ab5985、ab78002)孵育。GAPDH(ab128915，購自美國Abcam公司)作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 ZFAS1在ESSC組織和細(xì)胞中的表達(dá) 與癌旁組織相比，ZFAS1在食管癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(t=19.40,P<0.001，圖1A)。與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A相比，食管癌細(xì)胞Eca-109中的ZFAS1表達(dá)水平顯著增高(t=13.80,P<0.001，圖1B)。

圖1 ZFAS1在食管癌組織及細(xì)胞中表達(dá)

2.2 干擾ZFAS1表達(dá)抑制ESSC細(xì)胞增殖 與NC干擾組細(xì)胞相比，ZFAS1干擾組細(xì)胞的ZFAS1表達(dá)水平顯著降低(t=15.53,P<0.001),空白組與NC干擾組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.065,P>0.05，圖2A)。采用CCK-8檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性，與NC干擾組細(xì)胞相比，48、72及96 h測得ZFAS1干擾組細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別=2.933,8.568,10.04,P<0.05)，而24 h時(shí)沒有明顯差異(t=0.1960,P>0.05)?？瞻捉M與NC干擾組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別=1.434,1.260,0.1761,0.4214,均P>0.05，圖2B)。

圖2 ZFAS1干擾對食管癌細(xì)胞增殖的作用

2.3 干擾ZFAS1抑制ESSC細(xì)胞遷移 與NC干擾組細(xì)胞相比，ZFAS1干擾組細(xì)胞的遷移率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.96,P<0.001)，空白組和NC干擾組相比較，細(xì)胞遷移能力無明顯變化(t=0.6948,P>0.05，圖3)。

圖3 ZFAS1-siRNA對食管癌細(xì)胞遷移的作用(×40)

2.4 ZFAS1-siRNA促進(jìn)ESSC細(xì)胞凋亡 空白組和NC干擾組相比較，細(xì)胞凋亡率無明顯變化(t=0.4741,P>0.05)。與NC干擾組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ZFAS1干擾細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.68,P<0.001，圖4)。

圖4 干擾ZFAS1表達(dá)對食管癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點(diǎn) ZFAS1中存在能夠與miR-302b-3p結(jié)合的序列，圖5A。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點(diǎn)(t=2.925,P<0.05，圖5B)。而且ZFAS1可以通過ceRNA的方式調(diào)控miR-302b下游靶基因JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2的表達(dá)，圖5C。

圖5 ZFAS1靶向miR-302b-3p對JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2表達(dá)的調(diào)控作用

3 討論

越來越多研究顯示，哺乳動(dòng)物基因組編碼了大量長度超過200個(gè)核苷酸，蛋白質(zhì)編碼能力有限的LncRNA，這些LncRNAs長度超過200個(gè)核苷酸，具有有限的蛋白質(zhì)編碼能力[9]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生LncRNA的蛋白質(zhì)編碼基因中有18%與癌癥有關(guān)，而所有人類蛋白質(zhì)編碼基因中僅有9%與癌癥有關(guān)[10]。鑒于LncRNAs在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，且參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種活動(dòng)，因此大量研究圍繞LncRNAs在癌癥病理過程的作用展開[11]，識(shí)別和研究與癌癥相關(guān)的LncRNAs對于理解LncRNAs在癌癥進(jìn)展中的作用至關(guān)重要，并可能對發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)發(fā)揮重要作用。

ZFAS1是一種新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA[12]。最近的證據(jù)表明ZFAS1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-17]。例如，ZFAS1在乳腺癌[13]、結(jié)直腸癌[14,17]、胃癌[15-16]中均有表達(dá)改變。此外，ZFAS1的表達(dá)與肺癌[18]、結(jié)直腸癌[14]、胃癌[15]患者的預(yù)后相關(guān)。目前罕有關(guān)于ZFAS1與食管癌的報(bào)道，Shi等[19]發(fā)現(xiàn)ESCC組織中的ZFAS1表達(dá)明顯高于相應(yīng)的鄰近正常組織，且高ZFAS1表達(dá)的ESCC患者總體生存率較低，本研究結(jié)果與Shi等的發(fā)現(xiàn)一致。本研究通過qRT-PCR檢測正常食管細(xì)胞及食管癌細(xì)胞的ZFAS1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞表達(dá)ZFAS1水平較正常細(xì)胞高。此外，通過干擾Eca-109細(xì)胞表達(dá)ZFAS1，該細(xì)胞的增殖、遷移能力受到明顯抑制，且凋亡率升高。以上結(jié)果提示ZFAS1在食管癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮了促進(jìn)作用。

近期有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可通過靶向內(nèi)源性RNA發(fā)揮作用，即LncRNA可能作為競爭miRNA的競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，從而負(fù)調(diào)控miRNA的表達(dá)[20]。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)LncRNADANCR可作為一個(gè)ceRNA在膠質(zhì)瘤中通過靶向miR-634調(diào)控RAB1A的表達(dá)。Gao等[22]發(fā)現(xiàn)LncRNA FLVCR1-AS1通過靶向miR-573上調(diào)E2F3的表達(dá)，促進(jìn)肺癌的增殖和侵襲。為研究ZFAS1作用食管癌的潛在機(jī)制，本研究首先通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ZFAS1中存在能夠與miR-302b-3p結(jié)合的序列，隨后用熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點(diǎn)。miR-302基因簇首先發(fā)現(xiàn)于人類胚胎干細(xì)胞，包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d和miR-367。近年來，miR-302簇已被證明在癌細(xì)胞的增殖、分化及其致瘤性中發(fā)揮重要作用[23]。目前關(guān)于miR-302b-3p的研究較少，Tan等[24]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-302b-3p可通過直接靶向JNK2基因在加速皮膚衰老過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用；Guo等[25]發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p可靶向作用IGF-1R抑制胃癌細(xì)胞增殖。此外有研究證實(shí)IRAK4和EphA2同樣是miR-302b-3p的作用因子。本研究在證實(shí)miR-302b-3p為ZFAS1的作用靶點(diǎn)后，分別檢測空白組、ZFAS1干擾組及ZFAS1干擾+miR-302b-3p抑制劑組的JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示與空白組相比，ZFAS1干擾組的4個(gè)蛋白均表達(dá)減少，但添加miR-302b-3p抑制劑可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，說明ZFAS1在食管癌細(xì)胞中通過miR-302b-3p調(diào)控JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2。

綜上所述，本研究證實(shí)ZFAS1是食管癌的一個(gè)新的潛在致癌基因，它可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及抑制凋亡發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)ZFAS1可以通過ceRNA的方式調(diào)控miR-302b-3p下游靶基因JNK2、IGF-1R、IRAK4和EphA2的表達(dá)。對參與ZFAS1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移及凋亡反應(yīng)的上下游調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究的發(fā)現(xiàn)可能為揭示ZFAS1在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供新線索，并為食管癌的治療提供新方向。