智 鵬，楊 波，陳浩然，陳熙勐，遲小華，張鈞棟，郭 斌，李卓陽，劉格良，張皓旻，王毅興，盧學春

2019年12月31日，研究人員在武漢報道的數(shù)個不明原因肺炎病例中發(fā)現(xiàn)了一種未知的冠狀病毒，即新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV)[1]。感染2019-nCoV后，絕大多數(shù)患者初始癥狀多為發(fā)熱、乏力和干咳，引起傳染性疾病-新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)，但目前尚缺乏疫苗，也沒有特效的抗病毒藥[2]。國家衛(wèi)健委頒布的診療指南中明確提出，可用α干擾素霧化吸入進行抗病毒治療[3]。本研究通過分析α干擾素抗病毒相關全基因組表達譜，探索其對COVID-19的潛在治療意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究以“interferon-alpha”為關鍵詞在基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)進行檢索，并以①物種為人；②至少2個生物重復；③實驗設計思路清晰、數(shù)據(jù)質(zhì)量好為標準進行篩選。

1.2 實驗設計 本研究所使用的數(shù)據(jù)集均為經(jīng)GEO數(shù)據(jù)庫預處理后的轉錄組表達譜矩陣。根據(jù)數(shù)據(jù)來源實驗描述以及各樣本類型，將數(shù)據(jù)設定為對照組與處理組。

1.3 差異表達基因識別 在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)網(wǎng)站下載生物信息分析的R語言程序[5]。利用Impute程序包對已獲取的表達譜進行歸一化處理[6]。同時利用注釋包對數(shù)據(jù)進行注釋，將探針對應到基因上，隨后利用Limma程序包以|logFC|>1，F(xiàn)DR<0.05作為閾值篩選處理組與對照組的差異表達基因。

1.4 富集分析 利用基因本體學(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(the kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析[7]。采用Fisher確切概率法，以FDR<0.05，P<0.05作為篩選條件，以獲得差異表達基因富集的生物學進程(Biological Processes,BP)、細胞組分(cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)和KEGG通路。

1.5 構建顯著性基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡 使用STRING開源數(shù)據(jù)庫對前述顯著性基因構建蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡[8]。以可靠性閾值大于0.4作為截斷值并將數(shù)據(jù)下載。隨后將數(shù)據(jù)導入Cytoscape可視化分析軟件對PPI網(wǎng)絡進行可視化，去除游離節(jié)點，使用Degree算法評估網(wǎng)絡中基因節(jié)點的重要性，選取degree值前十位的基因作為核心基因[9]。

1.6 疾病關聯(lián)分析 本研究前期基于“系統(tǒng)生物學”和“比較功能基因組學”理論設計了“整合多組學分析”算法，并以此為基礎建立了涵蓋所有疾病、9 000多種臨床常用藥物、1 000多種中藥以及近10萬種化合物的人體功能基因組學大數(shù)據(jù)的臨床生物信息學表觀精準治療預測平臺(epigenomic precision medicine prediction platform，EpiMed)[10-11]。應用該平臺對上述差異表達基因進行多組學關聯(lián)分析，尋找α干擾素的適應證及為后續(xù)優(yōu)化含α干擾素的新冠病毒病治療聯(lián)合方案提供理論依據(jù)。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)篩選 共計檢索出2 478條結果，根據(jù)篩選標準在結果中再次篩選包含α干擾素處理組與對照組實驗數(shù)據(jù)的全基因組RNA表達芯片數(shù)據(jù)集。最終選擇并下載符合本研究要求的GSE5542數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集來源于GPL96平臺(affymetrix human genome U133A array)。作用對象為A549細胞，細胞培養(yǎng)條件為：DMEM(西格瑪，圣路易斯，美國)與10%胎牛血清(FBS)(歐米茄科學公司，圣弗南度谷,加拿大)。將未經(jīng)α干擾素處理組數(shù)據(jù)設為對照組，經(jīng)α干擾素處理6 h和24 h的數(shù)據(jù)分別設為6 h處理組和24 h處理組。

2.2 差異表達基因識別 共發(fā)現(xiàn)6 h處理組有311個差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因212個，下調(diào)差異表達基因99個；24 h處理組有303個差異表達基因，其中上調(diào)差異表達基因194個，下調(diào)差異表達基因109個，圖1。

圖1 差異表達基因

2.3 富集分析 GO 富集分析結果顯示，6 h處理組共富集BP 44條，CC 1條，MF 2條，24 h處理組共富集BP 50條，CC 12條，MF 3條，圖2。

圖2 GO富集分析

KEGG通路富集分析顯示，6 h處理組共富集217條KEGG通路，24 h處理組共富集209條KEGG通路(圖3),選取部分通路圖展示，圖4。分別為RIG-I樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、Th17細胞分化和人免疫缺陷病毒感染信號通路圖這些基因在紅色區(qū)域表達上調(diào)，在綠色區(qū)域下調(diào)。

圖3 KEGG通路分析

圖4 部分信號通路圖

2.4 PPI網(wǎng)絡分析及核心基因篩選 6 h處理組共得到294個蛋白，876條相互關系，平均點度5.96。24 h處理組281個蛋白，698條相互關系，平均點度4.97(圖5)，對PPI網(wǎng)絡中的基因進行節(jié)點得分計算，篩選得到排名前10位的核心基因，圖6。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡

圖6 核心基因

2.5 疾病關聯(lián)分析 以EpiMed平臺為依據(jù)，選取結果中6 h處理組和24 h處理組中與α-干擾素作用負相關的疾病和正相關的藥物，篩選得到疾病和藥物以及匹配靶點。部分結果見表1和表2。

表1 EpiMed疾病關聯(lián)分析

表2 EpiMed藥品關聯(lián)分析

3 討論

現(xiàn)階段，針對COVID-19的治療還處于研究階段，α干擾素雖已作為臨床治療的藥物已寫入診療方案并取得初步療效，但其治療機制尚不明確。本研究應用臨床生物信息學方法，對α干擾素的藥物功能基因組學數(shù)據(jù)開展研究，發(fā)現(xiàn)α干擾素發(fā)揮抗病毒作用不僅僅通過單一靶點或通路發(fā)揮作用，其作用是全基因組范圍的。

本研究發(fā)現(xiàn)，在α干擾素影響的基因中，大量基因與抗病毒有關，包括IRF7、OASL、ISG15等在內(nèi)的基因已經(jīng)有明確的文獻證實[12-14]。同時，還有大量基因與免疫激活、抗炎性反應以及抗腫瘤有關[15]。在信號通路方面，本研究發(fā)現(xiàn)，α干擾素的作用不僅限于抗病毒，如RIG-1樣受體能識別病毒核酸成分，此類RIG-I樣受體都定位在細胞內(nèi)膜結構上，病毒侵入細胞后，在酸性環(huán)境中釋放核酸物質(zhì)，進而被RIG-I樣受體識別，發(fā)揮抗病毒作用[16]；α干擾素可通過對JAK-STAT受體信號通路的抑制作用，影響細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等生物學過程，推測在2019-nCoV感染的治療中，α干擾素可能通過此通路減少正常細胞的凋亡，減輕對靶器官的損傷作用[17]。同時α干擾素還具有抗炎性作用，如Th17細胞信號通路，它是一類由原始CD4+T細胞分化而來的輔助性T細胞。Th17細胞可以分泌多種重要的細胞炎癥因子，其中最重要的是白介素17(interleukin-17，IL-17)與其受體結合后可誘導細胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF、趨化因子CXCL，趨化并激活中性粒細胞在局部浸潤，推測α干擾素可通過抑制炎性因子的產(chǎn)生而發(fā)揮對2019-nCoV感染的治療作用[18]。

利用EpiMed平臺進行多組學比對分析發(fā)現(xiàn)，α干擾素對社區(qū)獲得性肺炎等疾病具有治療作用，且潛在治療靶點中有大量基因發(fā)揮了關鍵作用，如MX1，OASL，ISG15等；同時，α干擾素針對膿毒癥等感染性疾病同樣具有潛在治療作用，且治療靶點中存在大量免疫相關基因[19]，提示α干擾素可通過影響免疫相關分子及信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而2019-nCoV感染可激活先天性和適應性的免疫反應，但不受控制的先天反應和受損的適應性免疫反應可能導致局部和全身組織損傷[20-21]。不僅如此，還與病毒性疾病、傳染性疾病和退行性關節(jié)炎等負相關，而這些疾病與本次新型冠狀病毒肺炎的臨床病理相似，據(jù)此推測α干擾素對COVID-19具有潛在治療作用。在藥物關聯(lián)分析中，與α干擾素呈正相關藥物包括利巴韋林、利托那韋、奈韋拉平、西多福韋、氟伐他汀等，在國家衛(wèi)健委辦公廳最新印發(fā)的診療方案中明確指出：利托那韋和利巴韋林為抗病毒治療藥物，且建議利巴韋林和干擾素聯(lián)合應用，與本研究結果一致。同時，西多福韋、氟伐他汀等藥物的發(fā)現(xiàn)對COVID-19的潛在藥物研究具有一定的借鑒意義。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，α干擾素具有抑制炎癥因子產(chǎn)生、免疫調(diào)節(jié)等方面的作用，為其用于COVID-19治療提供了初步的分子機制認識；篩選出的潛在藥物還有待于體內(nèi)外實驗的驗證。