高 嘯，沈 瑩

糖尿病是一種代謝性疾病，患者長期血糖水平異常偏高，或與高血壓共存，長此以往易造成器官受損、功能障礙或衰竭[1-2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一，約25%糖尿病患者終末期患上腎臟疾病[3]。盡管在DN治療方面取得了進步，但近年來發(fā)病率仍在急劇上升[4]。當前的治療包括控制血壓和血糖、降血脂以及保證腎功能，終末期患者使用透析或腎臟移植治療等。但此類治療僅用于減緩疾病的進展，還需要新的生物標志物和療法以減輕疾病的負擔并控制其他并發(fā)癥。研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)、Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的一系列復(fù)雜機制在糖尿病慢性炎癥的發(fā)展中起著重要作用[5]。本研究擬觀察DN模型小鼠體內(nèi)上述幾種蛋白表達情況，進一步探討HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白與DN的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和模型建立 C57BL/6雄性小鼠(8～9周)購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002,粵監(jiān)證字2008D007]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為12 h光照周期，溫度為(21.0±2.0)℃，相對濕度為50.0%～70.0%，自由進食、水。動物實驗經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過。注射日小鼠禁食禁水4 h，每日靜脈注射鏈脲菌素(STZ，1 g/瓶，北京索萊寶科技有限公司)55.0 mg/kg，連續(xù)5 d，共注射15只。同時給予15.0 g/L蔗糖水48 h。注射完成1周后，檢測空腹血糖，若大于16.0 mmol/L，則視為糖尿病小鼠；糖尿病小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，4周后出現(xiàn)尿蛋白，標志DN模型建立成功[6]。共構(gòu)建DN模型成功12只，隨機分為DN組和治療組，每組各6只小鼠。用生理鹽水替代STZ以相同方式給予另一批小鼠，作為對照組(共6只)。其中治療組小鼠給予胰島素(國藥準字H10890001，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)皮下注射治療，1/d，每次2.0 U。以造模成功后為第0周，共治療4周。DN組和對照組小鼠注射同等量生理鹽水代替胰島素，注射時間和劑量相同。

1.2 HMGB1拮抗劑A Box對小鼠DN模型的影響將DN組6只小鼠隨機抽取3只給予人重組HMGB1拮抗劑A Box(HMGBiotech Srl公司，意大利)注射，另外3只小鼠以生理鹽水替代A Box注射，每次400.0 μg，每周3次，共處理10周；對照組同樣方法處理。

1.3 樣品收集 DN組于建模完成后1 d、3 d和1周取尾部靜脈血2 mL，治療組控制血糖在10 mmol/L內(nèi)后1 d、3 d和1周后取尾部靜脈血2 mL，對照組小鼠和DN組同期取1 d、3 d和1周尾部靜脈血2 mL，以檢測相關(guān)蛋白和mRNA水平。建模14周后，處死全部小鼠，收集血液用以檢測血糖水平，收集尿液用以對尿白蛋白定量。收集腎臟、脾臟和胰腺組織切片用10%中性緩沖的福爾馬林固定以進行石蠟包埋，冷凍于OCT化合物中或速凍于液氮中以進行mRNA提取。

1.4 指標檢測

1.4.1 小鼠尿白蛋白定量和血糖檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量集(Bethyl Laboratories公司，蒙哥馬利，TX，USA)對白蛋白進行定量。取尾靜脈血使用血糖儀監(jiān)測其含量。

1.4.2 HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白水平檢測 使用ELISA法檢測HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB蛋白水平，試劑盒購于Shino-TestCorporation(日本Kanagawa公司)。利用實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平，所有結(jié)果均以2-ΔΔCt法計算和表示[7]。

1.4.3 組織學(xué)染色 將固定在福爾馬林中的腎臟切片使用高碘酸-席夫染色(periodic acid-schiff，PAS)和天狼星紅染色(picro sirius red stain，PSR)，全部操作按照試劑盒說明書步驟完成。在PSR染色切片上對腎小管間質(zhì)膠原進行評估，光鏡下放大切片(×400)，選取連續(xù)20個視野，計算網(wǎng)格中腎小管間質(zhì)膠原所占的百分比[8]。只計算腎小管間質(zhì)膠原，排除血管和腎小球。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 與對照組比較，DN組和治療組小鼠體質(zhì)量、血糖和尿白蛋白定量均明顯增加(t分別為6.782、10.806、9.712，P<0.01；t分別為6.533、3.161、7.208，P<0.01)；與DN組比較，治療組上述各指標均明顯下降(t分別2.324、7.038、2.942，P<0.05)，表1。DN組小鼠PAS染色可見腎小球肥大，系膜細胞增生系膜基質(zhì)增多增厚，治療組腎小球肥大情況緩解，圖1。

圖1 3組小鼠腎臟腎小管PAS染色(×400)

表1 3組小鼠一般情況比較

2.2 3組小鼠的HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4及NF-κB水平變化 DN組建模完成后1 d、3 d和1周HMGB1、RAGE、TLR4，NF-κB水平均較對照組明顯升高(P<0.05)，治療組小鼠控制血糖在10 mmol/L內(nèi)后1 d、3 d和1周后的HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB水平均較對照組明顯升高(P<0.05)；與DN組比較，治療組各時間段上述幾種蛋白水平均明顯偏低(P<0.05，表2)。

表2 DN小鼠不同時間點HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB水平變化(μg/L)

建模完成各時間段DN組和治療組HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平均明顯高于對照組(P<0.01)；與DN組比較，治療組各時間段上述幾種mRNA水平均明顯偏低(P<0.05)，表3。

表3 DN小鼠不同時間點HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平變化(2-△△Ct)

2.3 HMGB1對小鼠DN模型的影響 在DN模型小鼠腎小管間質(zhì)觀察到明顯間質(zhì)膠原蛋白沉淀，對照組小鼠中未觀察到。給予A Box后，生理鹽水處理小鼠組織學(xué)染色無明顯變化(t=0.086，P=0.933)，DN模型小鼠沉淀明顯減少(t=3.014，P=0.013)，表4，圖2。

表4 HMGB1對小鼠DN模型腎小管間質(zhì)膠原蛋白百分比的影響

圖2 HMGB1 A Box對腎臟腎小管間質(zhì)的影響(PSR染色×400)

3 討論

糖尿病高血糖導(dǎo)致細胞代謝反應(yīng)的各種變化，包括活性氧生成的增加和晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)的形成[9-10]。后者可以與各自的受體(RAGE)相互作用，誘導(dǎo)一系列代謝反應(yīng)，導(dǎo)致促炎細胞因子的產(chǎn)生和分泌[11-12]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，一系列促炎癥介質(zhì)都與糖尿病的發(fā)病有關(guān)，包括腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1b、白細胞介素-8和HMGB1等[13]。HMGB1本身可以通過RAGE、TLR2和TLR4發(fā)出信號，最終導(dǎo)致NF-kB的激活，NF-kB在造血細胞和內(nèi)皮細胞中誘導(dǎo)白細胞粘附分子的上調(diào)和促炎細胞因子和血管生成因子的產(chǎn)生，從而促進炎癥[14]。此外，NF-kB的激活誘導(dǎo)HMGB1受體的表達，增加HMGB1的分泌可介導(dǎo)炎癥和血管生成的放大，并增加與其相互作用的受體的表達，從而形成HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路。本研究中，通過注射STZ建立DN模型，后通過胰島素治療小鼠模型，發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎小球明顯肥大、血糖和尿白蛋白明顯升高，符合模型臨床表現(xiàn)。本研究檢測HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中各種關(guān)鍵蛋白的表達，結(jié)果顯示，DN模型小鼠體內(nèi)HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB蛋白和mRNA水平均明顯高于對照組(P<0.05)。但DN模型小鼠經(jīng)胰島素治療后，上述蛋白和mRNA水平均明顯下調(diào)，說明在DN中HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB表達均明顯上調(diào)，與既往研究結(jié)果一致。

另外，本研究驗證了一種假設(shè)，即HMGB1可阻斷HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達從而阻止DN的發(fā)展。先建立DN模型，后給予HMGB1拮抗劑A Box，特異性的拮抗HMGB1與TLRs和RAGE的結(jié)合。通過PSR染色觀察了腎小管間隙膠原蛋白沉淀情況。結(jié)果顯示，給予HMGB1 A Box后DN小鼠間質(zhì)膠原蛋白沉淀明顯減少。腎臟受損傷后會形成各種慢性不可逆的改變，腎小管間隙被大量間質(zhì)膠原蛋白和細胞外基質(zhì)等替代，終致使間質(zhì)纖維化，而這種纖維化的程度與范圍均與腎損傷密切相關(guān)[15]。因此，HMGB1的拮抗可抑制腎損傷的進一步發(fā)生，也說明HMGB1 A Box為防止DN的發(fā)展提供了重要的保護。

綜上所述，HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB在糖尿病腎病小鼠中表達增高，阻斷HMGB1和RAGE、TLRs結(jié)合，能夠阻止DN發(fā)展。