武麗瓊 冀云鵬 朱博 張美玲 康文光 王艷 周雪原 侯東霞 郭志遠(yuǎn) 王曉華

苯丙酮尿癥(PKU)是一種先天性代謝病，其特征是苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因突變，苯丙氨酸羥化酶活性的喪失導(dǎo)致血液苯丙氨酸濃度過高，這將對大腦造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。未經(jīng)治療的PKU患兒通常伴隨進(jìn)行性智力障礙和其他嚴(yán)重癥狀，包括濕疹、皮疹、自閉癥、癲癇發(fā)作和運(yùn)動障礙等。隨著患兒的成長，可以觀察到發(fā)育遲緩、行為異常及精神癥狀等。血液中苯丙氨酸(Phe)濃度升高是導(dǎo)致患兒精神缺陷的根本原因； Guthrie引入了一種基于大規(guī)模篩查檢測PKU的方法，稱為Guthrie檢測[1]。目前，世界上許多地區(qū)都采用Guthrie檢測或其他生化方法(如熒光檢測法或酶比色法)來進(jìn)行新生兒血液中Phe濃度檢測，用于PKU的診斷和鑒別診斷。這些方法具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)勢。但酶法的準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度較低，熒光法檢測快速、微量，其靈敏度和精確度明顯高于酶法，但檢測單個(gè)樣本時(shí)比較費(fèi)時(shí)。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)是一種檢測與代謝疾病相關(guān)的多種生物標(biāo)志物的新方法。HPLC-MS/MS技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、易自動化、耗時(shí)短、試劑費(fèi)用低、可以獲取更多的定性信息等優(yōu)點(diǎn),大大提高了定量分析的準(zhǔn)確性,是臨床及科研工作中測定氨基酸的一種有效方法。與目前應(yīng)用較多的酶法、熒光法相比較，該方法最大優(yōu)點(diǎn)在于能夠在短時(shí)間內(nèi) (2 min) 對一個(gè)樣品中的幾十種物質(zhì)進(jìn)行定性和定量，達(dá)到“一種實(shí)驗(yàn)檢測多種疾病”的目的。另外,由于HPLC-MS/MS技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)的分子量進(jìn)行定性，根據(jù)離子強(qiáng)度進(jìn)行定量 ,從而具有較高的靈敏度和特異度。

本研究通過HPLC-MS/MS技術(shù)檢測血濾紙片中Phe和Tyr濃度及其比值，同時(shí)采用時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)法作為對照，對內(nèi)蒙古地區(qū)新生兒PKU進(jìn)行篩查，為內(nèi)蒙古地區(qū)PKU的診斷、治療和預(yù)防提供一定的參考依據(jù)。

對象與方法

1.研究對象：2015年10月—2017年8月在內(nèi)蒙古地區(qū)婦幼保健院分娩，并采集了血標(biāo)本的新生兒12 910例為研究對象，其中12例因樣本污染、2例因臨床信息有誤被排除，最終共有12 896例新生兒納入本研究。

2.標(biāo)本采集：在新生兒出生72 h內(nèi)，收集足底外周血，在Whatman 903濾紙(Maidstone，UK)上點(diǎn)樣，然后在室溫下避光風(fēng)干，并將濾紙干血片樣本密封于真空塑料袋，保存于4℃冰箱。對于體重低于2 500克的新生兒，樣品采集將推遲，直至體重達(dá)到2 500克后再采樣。所有新生兒父母在收集樣本前均已提交書面知情同意書。

3.檢測流程：樣本分別采用HPLC-MS/MS和TRFIA兩種方法進(jìn)行PKU篩查。將篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的患兒召回進(jìn)行二次復(fù)查，若結(jié)果依舊為高風(fēng)險(xiǎn)，則采用Sanger測序進(jìn)一步對PKU相關(guān)基因PAH和PAH輔酶BH4的全部外顯子區(qū)域及內(nèi)含子/外顯子交接區(qū)進(jìn)行檢測，若發(fā)現(xiàn)同源變體，則該患兒被確認(rèn)為陽性病例。此外，還將檢測高風(fēng)險(xiǎn)患兒父母的基因，以確定患兒的變異來源。

4.HPLC-MS/MS檢測：將直徑為3.2 mm的干血斑置于 96孔過濾板中，每孔加入含有氨基酸和酰基肉堿同位素內(nèi)標(biāo)的100 μL抽提緩沖液 。在45 ℃下以750 rpm振蕩密封孵育45分鐘后，將75 μl提取物轉(zhuǎn)移至API3200MD(Applied Biosytems，USA)用于進(jìn)一步分析。在前體離子掃描模式下掃描內(nèi)標(biāo)酰基肉堿，在27 eV碰撞能量下質(zhì)荷比(m/z)為85，并且在中性丟失譜掃描模式下用m/z 102(12eV)掃描氨基酸。利用軟件NeoBase(Perkin Elmer)和GCMS Solution(Shimadzu)分析并予以整理分析。測試結(jié)果phe濃度>120 nmol/l(即2 mg/dl)，phe/tyr濃度比>1.5即為高風(fēng)險(xiǎn)。

5.TRFIA檢測：使用新生兒苯丙氨酸試劑盒(PerkinElmer，F(xiàn)inland)分析新生兒的血液Phe濃度。在每個(gè)直徑為3.2 mm的干血斑中打孔取樣后，置于含15 μl提取緩沖液的96孔酶標(biāo)板中。將板在室溫下孵育60 min，加入40 μl超純水并混合，之后將25 μl混合物轉(zhuǎn)移至含有50 μl茚三酮的96孔滴定板中。在60 ℃溫育60分鐘，加入200 μl銅試劑，將平板在60℃下恒溫90分鐘，最后轉(zhuǎn)移至Multilabel Counter(1420 VICTOR2D，PerkinElmer)進(jìn)行Phe濃度測試。定量時(shí)，該批次包含1個(gè)空白品、6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(0.4 mg/dl、1.6 mg/dl、2.8 mg/dl、5.2 mg/dl和15.0 mg/dl)和2個(gè)質(zhì)量對照(1.3 mg/dl和5.2 mg / dl)。測試結(jié)果Phe濃度>2 mg/dl即為高風(fēng)險(xiǎn)。

6.Sanger測序：兩種方法篩選出的高風(fēng)險(xiǎn)病例進(jìn)行PAH及輔酶BH4的Sanger測序，結(jié)合血液Phe濃度最終確診PKU病例。對PAH基因的13個(gè)外顯子及其內(nèi)含子交接區(qū)域的10 bp內(nèi)含子進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。

7.追蹤回訪：對于篩查結(jié)果為陽性，測序結(jié)果為陰性的患兒每月監(jiān)測Phe濃度是否低于2 mg/dl，持續(xù)半年以上，并且每半年一次電話追蹤回訪，詢問患兒生長發(fā)育、精神表現(xiàn)、皮膚毛發(fā)表現(xiàn)等是否正常，確保沒有遺漏的陽性病例。

8.倫理審查：該研究由內(nèi)蒙古婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并監(jiān)督。

結(jié)果

1. TRFIA篩查結(jié)果：31例患者被篩選為高風(fēng)險(xiǎn)患者，phe平均水平為(3.5±0.8)mg/dl。

2. HPLC-MS/MS篩查結(jié)果：2例患者被篩選為高風(fēng)險(xiǎn)患者，Phe水平分別為8.4 mg/dl和12.1 mg/dl，Phe / Tyr比值分別為2.3和 3.8。HPLC-MS/MS檢測的2例高風(fēng)險(xiǎn)病例包含在TRFIA檢測的31例高風(fēng)險(xiǎn)病例中。

3. Sanger測序結(jié)果：通過Sanger測序進(jìn)一步分析了篩查出的31例高風(fēng)險(xiǎn)患者。結(jié)果顯示HPLC-MS/MS和TRFIA均篩查為高風(fēng)險(xiǎn)的2例患者分別是PAH的雙重突變雜合子突變體(Y356X×R53H；R241C×IVS4-1G>A)，其余29例僅TRFIA篩查為高風(fēng)險(xiǎn)的患者中有5例PAH的雜合子突變體(IVS12-286A>C IVS12+6T>A、Y204C、R413P和R243Q)。見表1。5例雜合子突變體患兒經(jīng)隨訪至今，未發(fā)現(xiàn)陽性病例。

表1 7例新生兒的PKU篩查結(jié)果和最終測序結(jié)果

討論

新生兒疾病篩查是國家重大缺陷預(yù)防戰(zhàn)略的重要組成部分，已在各省市廣泛實(shí)施。區(qū)域性新生兒篩查項(xiàng)目于2008年首次引入內(nèi)蒙古，此后逐步從城市向農(nóng)村推廣，發(fā)展成為覆蓋內(nèi)蒙古大部分地區(qū)的完整篩查網(wǎng)。在提高項(xiàng)目覆蓋率的同時(shí)，還需要更新篩選方法，減少假陽性率。

本研究以人群為基礎(chǔ)開展PKU篩查，在12 896例新生兒中，2例被鑒定為PKU患者，患病率為1/6 448，5例被鑒定為PAH雜合子變體的攜帶者。PKU患病率因種族和地區(qū)而異：在歐洲人中約為1 / 10 000，其中北愛爾蘭為1/4 400，德國為1/7 000[2]。在亞洲地區(qū)，日本相對較低(1/120 000)[3]。中國的平均比率約為1/11 188[4]，但南北差異大，南方地區(qū)相對較低。據(jù)報(bào)道，內(nèi)蒙古的近鄰寧夏回族自治區(qū)是PKU發(fā)病率最高的地區(qū)之一(1/3 065)[5]。內(nèi)蒙古的一份報(bào)告顯示，PKU的患病率為1/2 069[6]，而本研究中PKU的患病率為1/6 448，可能是隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷發(fā)展以及人群產(chǎn)前診斷意識的不斷提高，使得PKU患兒出生率有所下降。

比較國內(nèi)PAH突變體發(fā)現(xiàn)，R243Q、R413P和Y356X是最流行的突變?nèi)后w，在中國北方地區(qū)它們的相對突變率分別為21.7%，6.5%和6.1%[7]；中國漢族人群的相對突變率分別是26%，5%和5%[8]。Zhu等人發(fā)現(xiàn)R413P的突變率在南方地區(qū)(2.7%)與北方地區(qū)(8%)存在顯著差異[8]，其次是R241C，突變率在0.7%到5.0%之間。此外，IVS4-1G>A(2.0%)和R53H(2.0%)突變在國內(nèi)也很常見。而內(nèi)含子12中的突變IVS12-286A>C鮮有報(bào)道，IVS12 + 6T> A突變概率相對較低[9]。

比較亞洲地區(qū)PAH突變體發(fā)現(xiàn),R243Q是中國人群最常見的突變之一，在韓國和日本也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)這一突變。Y356X的突變概率在中國、日本和韓國相似(6.5%，4.9%和5.7%)[3,10]，而IVS4-1G>A在韓國比在中國和日本更普遍，R241在日本和韓國的頻率相對較高，但在中國較低?？偟膩碚f，R243Q、Y356X、R413P和IVS4-1G>A屬于亞洲地區(qū)PAH的常見突變。

PAH突變的基因型與表型的相關(guān)性比較明顯。大多數(shù)突變體可導(dǎo)致三種PKU表型中的一種，包括輕度高苯丙氨酸血癥(MHP)、輕度PKU和典型PKU。但在某些突變體中也有例外。例如，R243Q和Y356X常見于典型PKU(85%～91%)，但在輕度PKU中也發(fā)現(xiàn)了這兩種突變體。類似的情況也發(fā)生在PAH等位基因或非等位基因突變IVS4-1G>A，Y356X，R413P上[11-13]。Guldberg等人的假說認(rèn)為突變蛋白的多種生物學(xué)特性和功能導(dǎo)致了這些差異[14]。這些差異對于PKU的診斷是一個(gè)挑戰(zhàn)。通常建議在患兒接受飲食治療之前對PKU水平進(jìn)行明確的評估。大多數(shù)情況下，醫(yī)生必須綜合評估患兒在一定時(shí)期內(nèi)的臨床表現(xiàn)，以診治該病。本研究將2例PAH雙重突變雜合子的病例確診為典型PKU，而對于那些僅含有雜合突變體的病例，建議在確診之前定期檢測血液Phe水平，并進(jìn)行一定時(shí)間的隨訪。

內(nèi)含子變異產(chǎn)生的影響尚不清楚。為了確定這一特殊突變是否具有致病性，Shapiro等人引入了一個(gè)剪接分?jǐn)?shù)計(jì)算器，分別評估了ivs12+4a>g和ivs12+6t>a這兩種突變對PAH轉(zhuǎn)錄的影響[15]。研究表明，與正?；蚣艚酉啾?，這兩種變體都在很大程度上降低了PAH的剪接分?jǐn)?shù)。由此可以推測，內(nèi)含子的突變會通過影響剪接位點(diǎn)的識別來降低剪接效率，但其個(gè)體表型的影響程度尚需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒疾病篩查項(xiàng)目中，TRFIA和HPLC-MS/MS的檢測效果有很大差異。在TRFIA檢測中，RFIDA的假陽性率為0.22%(29/12 894)，而在HPLC-MS/MS方法中，未觀察到假陽性病例。目前，血液中Phe/Tyr比值已成為診斷PKU的金標(biāo)準(zhǔn)。HPLC-MS/MS已被證實(shí)是一種精確的檢測特定氨基酸的技術(shù)，可用于篩選PKU患者，HPLC-MS/MS較TRFIA方法，其檢測氨基酸分子類別更全面。對于PKU篩查而言，除了檢測Phe、Tyr濃度，而且其比值對于鑒別診斷PKU和暫時(shí)性高苯丙氨酸血癥具有重要參考價(jià)值。HPLC-MS/MS也適用于定量評價(jià)幾種生物標(biāo)志物，用于檢測PKU患者的治療效果，且檢測時(shí)間較短(每次運(yùn)行不到5 min)，可以每天檢測。值得注意的是，5例雜合變體都是通過TRFIA篩選出的，HPLC-MS/MS檢測這5例的Phe/Tyr比值正常。一般來說，突變攜帶者和正常受試者的血液PHE水平可能有輕微差異。HPLC-MS/MS方法的靈敏度較高，理論上應(yīng)該檢測到這種細(xì)微的差異，因此需要做進(jìn)一步的研究來解釋該現(xiàn)象。

綜上所述，本研究以HPLC-MS/MS為基礎(chǔ)，對內(nèi)蒙古地區(qū)新生兒進(jìn)行了PKU篩查。與TRFIA檢驗(yàn)相比，HPLC-MS/MS方法具有較高的靈敏度和特異度，可作為臨床常規(guī)篩查診斷方法。本研究發(fā)現(xiàn)了5種PKU的雜合變體。其中Y356X、R243Q和R413P的變異是中國北方最常見的突變。此外，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)含子的突變體：IVS12-286A>C，這在之前的研究中報(bào)道較少。