洪志丹 周春 張?jiān)?劉松梅 彭建紅 劉環(huán)宇

46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征是一種非常罕見(jiàn)的疾病，我國(guó)的發(fā)病率約1/20 000～25 000[1]，但其發(fā)病機(jī)制不清楚。本文對(duì)1例SRY陰性的46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者進(jìn)行系列檢查，包含精液分析、血清生殖激素測(cè)定、染色體核型分析、SRY基因及Y染色體微缺失檢測(cè)、外周血全外顯子測(cè)序，分析其遺傳學(xué)變化與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意。

臨床資料

患者，社會(huì)性別男性，28歲，已婚，與現(xiàn)配偶同居6年未避孕未育，于2016年3月就診。體檢：身高177 cm，體重85 kg，男性外觀；陰莖長(zhǎng)度6 cm(疲軟狀態(tài))，陰囊外觀正常，可觸及雙側(cè)睪丸，體積均約2 ml，質(zhì)地中，有觸痛。生殖系統(tǒng)超聲檢查提示雙側(cè)睪丸發(fā)育不良。因外生殖器異常于幼時(shí)行尿道下裂成形術(shù)、隱睪下降移位術(shù)及剖腹探查術(shù)，術(shù)中未見(jiàn)子宮及附件等女性內(nèi)生殖器組織，術(shù)后多次復(fù)查無(wú)異常發(fā)現(xiàn)。父母體健，非近親婚配，系獨(dú)生子女，家族中無(wú)類似病史。

常規(guī)精液分析結(jié)果：精液量1.6～2.2 ml。多次精液常規(guī)鏡檢均未見(jiàn)精子。血清生殖激素檢測(cè)結(jié)果：FSH 33.78 mIU/ml(正常范圍：1.27-19.26 mIU/ml)，LH 23.51 mIU/ml(正常范圍：1.24-8.26 mIU/ml)；E229 pg/ml(正常范圍：20-47 pg/ml)，T 1.66 ng/ml(正常范圍：0.75-7.8 ng/ml)，PRL 11.09 ng/ml(正常范圍：2.64-13.13 ng/ml)?；颊逨SH、LH均升高，提示高促性腺激素性腺功能不全。染色體核型及Y染色體微缺失分析結(jié)果：通過(guò)染色體G顯帶法及染色體非整倍體基因拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)兩種方法所測(cè)染色體核型均為46,XX，CNVs檢查未發(fā)現(xiàn)其他異常。PCR-探針?lè)z測(cè)SRY基因及Y染色體微缺失，結(jié)果顯示Y染色體AZFa(sY84、sY86)、AZFb(sY127、sY134)、AZFc(sY254、sY255)6個(gè)位點(diǎn)均缺失，SRY基因陰性。

全外顯子測(cè)序結(jié)果：患者目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度為97目，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度達(dá)到94.55%，其中測(cè)序深度達(dá)到20中以上的區(qū)域占芯片捕獲區(qū)域的92.86%，芯片對(duì)目標(biāo)區(qū)域覆蓋良好。外周血全外顯子變異全局總覽見(jiàn)圖1。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在9號(hào)染色體上DMRT1(chr9：841647-969090)基因發(fā)生了突變，具體為堿基T突變?yōu)锳 (chr9：841971)，導(dǎo)致其所編碼的氨基酸由S(絲氨酸)變?yōu)榱薚(蘇氨酸)。WNT4基因的剪切區(qū)發(fā)生了突變(chr1:22453975)，堿基C突變?yōu)镚。

圖1 變異全局

從最外層到最內(nèi)層依次是：(1)第一圈為染色體名稱。(2)第二圈為SNP密度(1Mb，曲線)，并對(duì)密度進(jìn)行了歸一化。(3)第三圈為測(cè)序深度，并進(jìn)行歸一化，小于0.25綠色，大于0.75紅色，其他灰色。(4)第四圈為不同類型的SV，深綠色代表插入，深藍(lán)色代表缺失，深紅色代表擴(kuò)增(淺綠，淺藍(lán)，淺紅為對(duì)應(yīng)的背景色)；(5)第五圈為InDel：藍(lán)色為插入，黃色為缺失。

討論

46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征由1964年由Delachapella[2]首次報(bào)道，發(fā)病率極低，約90%的患者Y染色體性別決定基因(sex-determining region on the Y chromosome，SRY)為陽(yáng)性，僅10%左右為SRY陰性[3]，其關(guān)鍵特征為“性腺性別與染色體性別不相符”，但目前對(duì)此病的了解十分有限。兒童患者常因外生殖器發(fā)育異常如尿道下裂、隱睪和生殖器畸形等就診，而成年男性患者多因不育、性腺功能減退、乳房發(fā)育等就診[4.5]。本病例出生時(shí)曾因尿道下裂行手術(shù)治療，當(dāng)時(shí)未作染色體等檢查，婚后因不育行精液檢查發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥，進(jìn)而行染色體核型分析從而確診。因此，對(duì)于外生殖器發(fā)育異常者進(jìn)行染色體分析在本病的診斷中具有重要的臨床意義。

人類性別決定的關(guān)鍵因素尚未完全闡明，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Y染色體及其中的睪丸決定因子在人類性別決定中扮演關(guān)鍵的角色，但其發(fā)病機(jī)制并不完全清楚。研究表明，Y染色體易位或是Y染色體缺失伴SRY基因易位是導(dǎo)致本病的最主要原因[6]。但在本研究中，G顯帶核型分析及CNVs分析并未發(fā)現(xiàn)與Y染色體可能相關(guān)的標(biāo)記染色體及DNA序列，且SRY基因、AZFa、b、c均缺失，基本可排除因Y染色體易位或SRY基因易位的致病原因。早期研究中，Mcelreavey K等推測(cè)[7]，由于促使睪丸發(fā)育的基因調(diào)控機(jī)制發(fā)生了隱性突變，致使在無(wú)SRY基因存在時(shí)睪丸也能發(fā)育，此類患者可能為常染色體隱性突變所致，或是常染色體、X染色體上存在未知的性分化決定基因。亦有可能其SRY基因局限于睪丸組織內(nèi)，而外周血DNA分析檢測(cè)不出致性反轉(zhuǎn)的基因變異[8]，該假設(shè)有待于進(jìn)一步證實(shí)。

隨著細(xì)胞分子生物學(xué)研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，調(diào)控人類性別發(fā)育的基因逐步被發(fā)現(xiàn)，目前已知的有SOX基因家族、DMRT基因、WNT4及RSP1基因等[9]。

性反轉(zhuǎn)相關(guān)的報(bào)道中較多的為SOX基因家族異常，而對(duì)DMRT及WNT4基因異常的報(bào)道罕見(jiàn)。DMRT基因簇定位于9p24.3，包括DMRT1、DMRT2、DMRT3基因[10]。DMRT1基因位于9(chr9：841647-969090)，它具有一個(gè)保守的DNA結(jié)合motif(具有特殊功能的蛋白質(zhì)分子超二級(jí)結(jié)構(gòu))，對(duì)性腺的發(fā)育和配子的形成扮演了決定性的作用。同時(shí)，DMRT1編碼了一個(gè)男性獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄因子，在所有脊椎動(dòng)物中起到調(diào)控睪丸分化的作用，該基因突變，可導(dǎo)致生殖細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行有絲分裂和生殖細(xì)胞的分化，影響精原細(xì)胞的產(chǎn)生，無(wú)法產(chǎn)生精子[9]。WNT4基因?yàn)閃NT基因家族的一員，位于1p36.12，是一類前卵巢基因/抗睪丸基因，在性腺分化的過(guò)程中，其過(guò)量表達(dá)會(huì)抑制睪丸的分化，促進(jìn)卵巢的分化[11.12]。本病例因不育就診，檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥，進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)高促性腺激素性腺功能不全、染色體核型與社會(huì)性別不符，不同于常見(jiàn)的生精功能障礙。

本病例高通量全外顯子測(cè)序結(jié)果顯示，SOX5、SOX8和SOX10基因的外顯子區(qū)域發(fā)生了單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)突變，但是屬于同義突變，其編碼的氨基酸序列并未發(fā)生改變。而DMRT1基因外顯子區(qū)域發(fā)生了SNP的非同義突變，致使其轉(zhuǎn)錄的氨基酸發(fā)生了變化，此結(jié)果證實(shí)了DMRT1基因突變導(dǎo)致無(wú)精子癥。在傳統(tǒng)的觀念中，認(rèn)為無(wú)精子癥是由于Y染色體的缺失致AZF缺失，導(dǎo)致生精障礙/無(wú)精子癥，此研究證實(shí)AZF缺失并非唯一導(dǎo)致無(wú)精子癥的原因。本病例發(fā)現(xiàn)WNT4基因剪切區(qū)的SNP突變，是導(dǎo)致了該基因失活、基因過(guò)量表達(dá)還是基因表達(dá)量降低，通過(guò)現(xiàn)有的方法無(wú)法明確。但結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果以及分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，我們推測(cè)，該基因剪切區(qū)的突變，導(dǎo)致患者WNT4基因表達(dá)量降低或是WNT4基因失活的可能性較大，因此患者性腺分化為睪丸組織。

在檢測(cè)結(jié)果中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他性別分化相關(guān)基因的重要有義突變，也未發(fā)現(xiàn)SRY基因片段的存在?；诂F(xiàn)有的研究結(jié)果可以明確，該患者在沒(méi)有Y染色體及性別決定相關(guān)基因的前提下，因WNT4剪切區(qū)的SNP突變可能導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物表達(dá)水平的降低或引起WNT4基因失活，導(dǎo)致性腺分化為睪丸組織。同時(shí)，其無(wú)精子癥的原因是由于AZF缺失、DMRT1外顯子區(qū)域的非同義突變雙重作用導(dǎo)致其精原細(xì)胞無(wú)法分化產(chǎn)生精子。

對(duì)于臨床診斷的性反轉(zhuǎn)病例，進(jìn)行基因診斷來(lái)明確致病原因有重要的意義。本研究采用高通量全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征進(jìn)行基因診斷及發(fā)現(xiàn)DMRT1基因突變均為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

綜上所述，SRY陰性的46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征是罕見(jiàn)的導(dǎo)致男性不育的疾病。本病例通過(guò)臨床、實(shí)驗(yàn)室及分子技術(shù)檢測(cè)方法，在成功找到突變基因后推測(cè)了其發(fā)生性反轉(zhuǎn)的可能機(jī)制。隨著不育癥發(fā)病率的增高，對(duì)于無(wú)精子癥患者建議常規(guī)行生殖激素測(cè)定、染色體核型、Y染色體微缺失檢測(cè)，必要時(shí)作CNVs及全外顯子測(cè)序，尤其兒童期如發(fā)現(xiàn)外生殖器異常應(yīng)及時(shí)行染色體核型分析，避免誤診漏診。對(duì)于該類有生育要求的患者，因其伴發(fā)的睪丸原發(fā)性生精障礙患者生育仍是一個(gè)難題，可采用供精助孕獲得后代。但由于現(xiàn)有方法的局限性，無(wú)法確定WNT4基因剪切區(qū)的突變對(duì)基因表達(dá)的具體影響，還需進(jìn)一步的研究。