王麗紅 吳慧麗 張利 李賓 劉迎

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院1消化內(nèi)科，2門診綜合診療中心（鄭州450000）

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅人類生命健康。臨床上治療肝癌常見的方式有手術(shù)切除、放射治療、免疫治療等，但HCC患者預(yù)后仍不理想［1］。自噬是細(xì)胞自我消化過程，可將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)衰老或受損細(xì)胞器及一些大分子物質(zhì)包裹在囊泡，形成自噬泡，與溶酶體融合，降解為小分子物質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［2］。自噬過程在細(xì)胞內(nèi)受嚴(yán)格調(diào)控，不僅是細(xì)胞正常生理狀態(tài)下的生存機(jī)制，同時(shí)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。在HCC發(fā)展過程中，自噬具有雙重作用，HCC發(fā)展初期，自噬可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在發(fā)展階段，自噬可為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）參與基因表達(dá)與調(diào)控，與自噬過程密切相關(guān)，其通過對(duì)自噬水平的調(diào)控，影響腫瘤結(jié)局。miR-365是miRNA家族一員，在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于miR-365與HCC細(xì)胞自噬關(guān)系報(bào)道較少［5］。本研究通過探討miR-365在HCC中對(duì)自噬的作用及可能機(jī)制，旨在為治療HCC提供新的靶點(diǎn)和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料選取本院收治確診為HCC患者13例，其中男性8例，女性5例，年齡26 ～61歲，平均年齡（41.37 ± 5.16）歲，收集患者術(shù)后HCC組織與癌旁組織，保存于液氮中。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18歲；符合臨床HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者均接受根治術(shù)，術(shù)后經(jīng)病理驗(yàn)證為HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：無影像學(xué)資料及合并其他惡性腫瘤患者。

1.1.2 細(xì)胞系和試劑人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞L02購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco公司），含有miR-365激動(dòng)劑（miR-365-mimics）、無義隨機(jī)序列（miR-365-NC）的pcDNA3.1重組質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），兔抗人自噬相關(guān)基因3（autophagy related gene 3，ATG3）多抗、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3-II（microtubule-associated protein1 light chain3-II，LC3-II）多抗、p62單抗、Beclin1單抗（美國(guó)Abcam公司），HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞L02，放入含有10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。2 ～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于6孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、NC組（轉(zhuǎn)染miR-365無序?qū)φ招蛄衜iR-365-NC）過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-365-mimics）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率均＞85%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)組織與細(xì)胞中miR-365、ATG3 mRNA 表達(dá)水平取患者HCC組織與癌旁組織，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，HepG2肝癌細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞L02，Trizol法提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，70 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。miR-365以U6為內(nèi)參，ATG3以β-actin為內(nèi)參，采用2-CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況各組細(xì)胞，按2 × 105個(gè)/mL接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，20 μL/孔加入MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，150 μL/孔加入DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（A）值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況各組細(xì)胞按1 × 106個(gè)/mL接種于6孔板，培養(yǎng)48 h，胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，混勻，室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.2.5 電鏡觀察細(xì)胞自噬情況取各組細(xì)胞按1×106個(gè)/mL接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入4%戊二醛，4 ℃固定24 h，1%四氧化鋨4 ℃固定1 h，梯度乙醇和丙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片（片厚約100 μm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色后封片，電鏡觀察。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中ATG3、LC3-II、Beclin1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)水平取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，BCA法定量，蛋白變性，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的ATG3、LC3-II、Beclin1、p62一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗37 ℃孵育2 h，加入ECL曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-365 與ATG3靶向性根據(jù)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)miR-365與ATG3之間的結(jié)合位點(diǎn)，將ATG3-3′UTR插入熒光素酶報(bào)告載體pMIR-REPORT，分別構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒pMIR-ATG3-MT和突變型重組質(zhì)粒pMIR-ATG3-MUT，利用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-365-mimcs-NC/miR-365-mimcs與野生組和突變組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者組織與不同肝細(xì)胞系中miR-365 和ATG3 mRNA 表達(dá)情況HCC患者癌組織中miR-365、ATG3表達(dá)明顯低于癌旁組織（P ＜0.05），見圖1。肝癌SMMC-7721細(xì)胞、HepG2細(xì)胞中miR-365和ATG3表達(dá)均低于正常L02細(xì)胞（P ＜0.05），且SMMC-7721細(xì)胞較HepG2細(xì)胞更低（P ＜0.05），見圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SMMC-7721細(xì)胞。

2.2 SMMC-7721 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-365 和ATG3 mRNA 表達(dá)情況過表達(dá)組miR-365、ATG3相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、NC組（P ＜0.05），見圖3。

圖1 HCC 患者不同組織miR-365、ATG3 表達(dá)情況Fig.1 The expression of miR-365 and ATG3 in different tissues of HCC patients

圖2 不同細(xì)胞系中miR-365、ATG3 表達(dá)情況Fig.2 The expression of miR-365 and ATG3 in different cell line

圖3 各組細(xì)胞miR-365、ATG3 相對(duì)表達(dá)量比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of miR-365 and ATG3 in each group of cells

2.3 細(xì)胞增殖情況過表達(dá)組細(xì)胞A值明顯低于對(duì)照組、NC組（P ＜0.05）。見圖4。

2.4 細(xì)胞凋亡情況過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組、NC組（P ＜0.05），見圖5。

圖4 各組細(xì)胞A 值比較Fig.4 Comparison of cell A values in each group

圖5 各組細(xì)胞凋亡率比較Fig.5 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.5 透射電鏡觀察結(jié)果透射電鏡觀察顯示，對(duì)照組、NC組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常；過表達(dá)組出現(xiàn)大小不一、包裹細(xì)胞器的圓形自噬泡（箭頭指示），見圖6。

2.6 細(xì)胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白相對(duì)表達(dá)量過表達(dá)組細(xì)胞中ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、NC組，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組、NC組（P ＜0.05），見圖7。

圖6 透射電鏡觀察自噬（×25 000）Fig.6 Observation of autophagy under transmission electron microscope（×25 000）

圖7 細(xì)胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白表達(dá)Fig.7 Protein expression of ATG3，LC3-II，p62，Beclin1 in cells

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-365 與ATG3 靶向性生物學(xué)信息軟件顯示，ATG3存在miR-365結(jié)合位點(diǎn)，見圖8A；進(jìn)一步熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-365 mimics可明顯抑制野生型ATG3相對(duì)熒光素酶活性（P ＜0.05），而對(duì)突變型ATG3無明顯影響（P ＞0.05），見圖8B。

圖8 miR-365 靶向調(diào)節(jié)ATG3 表達(dá)（A：miR-365 與ATG3 存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)；B：miR-365 靶向抑制ATG3）Fig.8 miR-365 targeted regulation of ATG3 expression（A：miR-365 and ATG3 have continuous binding sites；B：miR-365 targeted inhibition of ATG3）

3 討論

自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切，通過探討腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，對(duì)治療腫瘤具有重要意義［6］。自噬通過降解細(xì)胞組分，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞正常代謝，并可防止化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受藥物作用，促進(jìn)細(xì)胞耐藥；另一方面，自噬也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，在治療癌癥中具有潛在效應(yīng)［7］。miRNA參與調(diào)控基因表達(dá)，通過調(diào)節(jié)自噬過程中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程表現(xiàn)出直接或間接調(diào)控作用，從而發(fā)揮抑癌或促癌作用，為腫瘤的治療提供新靶點(diǎn)和新思路［8］。

miRNA在腫瘤組織中通過上調(diào)或下調(diào)下游相關(guān)基因，對(duì)腫瘤的結(jié)局和預(yù)后產(chǎn)生不同影響［9］。不同腫瘤組織中miR-365表達(dá)存在差異，其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，在肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中低表達(dá)［10-12］。HE等［13］報(bào)道顯示，miR-365在HCC癌組織表達(dá)明顯低于癌旁組織，miR-365下調(diào)可通過多種途徑促進(jìn)HCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本研究通過檢測(cè)HCC患者癌組織與癌旁組織中miR-365表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織中miR-365表達(dá)顯著低于癌旁組織，與以上結(jié)果一致。為進(jìn)一步證實(shí)miR-365在HCC中的表達(dá)，本研究對(duì)不同HCC細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系中miR-365表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HCC細(xì)胞系中miR-365表達(dá)明顯低于正常肝細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-365在HCC中低表達(dá)。為揭示miR-365在HCC中作用機(jī)制，本研究采用miR-365轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-365過表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡率升高，與JIANG等［14］研究結(jié)果一致，提示過表達(dá)miR-365可抑制HCC細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡。

過表達(dá)miR-365可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，阻止原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)，通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡是抑癌的重要分子機(jī)制之一［15-16］。在肥大型心肌細(xì)胞中，miR-365表達(dá)顯著上調(diào)，可負(fù)向調(diào)控心肌細(xì)胞自噬，引起自噬失調(diào)［17］。細(xì)胞自噬受機(jī)體多種基因和蛋白嚴(yán)密調(diào)控，參與調(diào)控自噬的基因統(tǒng)稱為ATG家族，其中ATG3參與調(diào)節(jié)LC3蛋白脂化系統(tǒng)［18］。LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，發(fā)生自噬時(shí)，Ⅰ型經(jīng)泛素樣修飾轉(zhuǎn)變成Ⅱ型，LC3-Ⅱ含量與自噬泡數(shù)量成正比，是發(fā)生自噬的標(biāo)志性蛋白。Beclin1是自噬啟動(dòng)因子，其活性下降或缺失抑制自噬的啟動(dòng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。p62蛋白是自噬負(fù)性調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)自噬降解途徑。本研究轉(zhuǎn)染miR-365后，透射電鏡提示細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)一步經(jīng)Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-365后，ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白表達(dá)升高，p62蛋白表達(dá)下降，提示過表達(dá)miR-365抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)。

miR-365下游有眾多靶基因，通過調(diào)節(jié)不同靶基因表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能［19］。本研究通過miR靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-365與ATG3存在相互結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-365與ATG3之間存在靶向性，與YANG等［20］研究結(jié)果一致，由此推測(cè)，過表達(dá)miR-365可能是通過靶向促進(jìn)ATG3表達(dá)，激活細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所示，過表達(dá)miR-365可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞自噬，從而抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡，其可能是通過靶向上調(diào)ATG3表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，為臨床治療HCC提供新的治療靶點(diǎn)。