高卓維 陳廣鴻 符路娣

1廣州中醫(yī)藥大學順德醫(yī)院（廣東佛山528300）；2南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院分子生物學實驗室國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室（廣州510515）；3廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心（廣州510405）

膠質瘤是人類中樞神經系統中非常常見的惡性腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強、病死率高和致殘率高的特點，約占成人惡性腦腫瘤的81%［1］。目前，膠質瘤主要的臨床治療方法是手術切除結合術后放療、化療的綜合療法［2-3］。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是用于神經膠質瘤治療的一線化療藥物，具有明確的療效。然而替莫唑胺的療效經常受到藥物敏感性下降和化療耐藥性的限制。既往研究發(fā)現傳統化療藥物聯合中藥，能夠增加抗癌療效和減輕單藥不良反應。芍藥苷（Paeoniflorin）是臨床常用中藥芍藥內的主要有效成分，近年來的研究發(fā)現芍藥苷具有抗腫瘤作用，能夠抑制多種腫瘤的生長［4］。本研究對芍藥苷協同替莫唑胺抑制原代腦膠質瘤細胞的作用進行研究，觀察聯合作用對原代腦膠質瘤細胞體外增殖和遷移的影響，探討芍藥苷協同替莫唑胺治療膠質瘤的量效關系和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料c-Myc（#18583）、MMP-2（#40994）、MMP-9（#13667）、GAPDH（#5174）抗體購自美國CST生物科技有限公司，Src（ab109381）、p-Src（Tyr419，ab185617）、STAT3（ab68153）、p-STAT3（Tyr705，ab76315）、CyclinD1（ab134175）購自美國Abcam有限公司。芍藥苷由廣東藥科大學仇志坤博士饋贈、替莫唑胺購買自左克有限公司。MTS購買自Promega有限公司。結晶紫染色液購買自凱基生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購買自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法提取膠質瘤原代細胞。其中：人腦膠質瘤瘤體組織來自廣州中醫(yī)藥大學順德醫(yī)院神經外科術后的病理標本。成功提取的原代腦膠質瘤細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在生長至80%進行傳代，用0.25%胰蛋白酶（含0.2%EDTA）消化細胞，并轉移到新培養(yǎng)皿中進行進一步培養(yǎng)。實驗所用原代膠質瘤細胞控制在4代以內。本研究經過原佛山市順德區(qū)中醫(yī)院倫理委員會審查。

1.3 MTS 法檢測原代腦膠質瘤細胞增殖活力取對數生長期的原代腦膠質瘤細胞，消化、離心，調整細胞密度至5 × 103個接種于96孔板中，待細胞貼壁長至約80%后，分別給予不同濃度的芍藥苷或替莫唑胺處理，培養(yǎng)24或48 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTS稀釋液（將MTS試劑以1∶6的比例加入至含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基中），于37°C，5%CO2孵箱孵育1 h，酶標儀檢測吸光度并計算細胞活力。細胞活力=［OD-OD（空白）］/［OD（對照）-OD（空白）］×100%。在確定芍藥苷和替莫唑胺的抑制濃度后，檢測兩者藥物組合對原代膠質瘤細胞活力的影響。通過繪制等效線圖和計算組合指數CI（CI ＜1，協同作用；CI = 1，相加作用；CI ＞1，拮抗作用）來確定最佳協同作用的藥物比例。以此為依據設定給藥濃度進行后續(xù)EdU染色、Transwell細胞遷移和Western blot檢測。

1.4 EdU 染色檢測細胞增殖能力取對數生長期的原代腦膠質瘤細胞，消化、離心、調整細胞密度至5 × 103個接種于96孔板中，待細胞貼壁長至約80%后，分為對照組、芍藥苷組、替莫唑胺組、芍藥苷+替莫唑胺組，并在培養(yǎng)基中加入EdU處理48 h后，4%多聚甲醛固定細胞，然后分別依次采用1×Apollo?染色液和1×Hoechst33342反應液室溫孵育各30分鐘。在熒光顯微鏡下隨機計數3個視野中細胞總數（呈藍色）及EdU陽性細胞數（呈紅色），EdU陽性百分比= EdU陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5 Transwell 細胞遷移實驗取對數生長期的原代腦膠質瘤細胞，按照約1 × 105個/孔的細胞密度分別用500 μL含不同藥物的含藥無血清DEME培養(yǎng)基重懸后加入Transwell小室上室，下室置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，孵箱中孵育16 h，孵育結束后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色液染色15 min，最后棉簽旋轉輕柔地擦去上室未遷移的細胞。于倒置顯微鏡下每組隨機選取5個視野進行拍照計數。Image J軟件統計每組遷移細胞數。

1.6 反向藥效團對接即使探索芍藥苷治療膠質瘤的作用靶點通過TCMSP數據庫下載（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）芍藥苷的空間構象，將芍藥苷的3D結構上傳到反向藥效團對接分析數據庫PharmMapper（http：//lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）進行分析，尋找芍藥苷潛在作用靶點。候選靶點經過篩選后通過STRING數據庫（https：//string-db.org/）分析其相互作用。

1.7 細胞蛋白檢測將原代腦膠質瘤細胞在6孔板上培養(yǎng)，待生長至80%將細胞分為對照組、芍藥苷組、替莫唑胺組、芍藥苷+替莫唑胺組。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，并用預冷的PBS洗滌。每孔加入100 μL RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解。收集裂解五轉移至1.5 mL EP管中，漩渦振蕩3 min，然后4 ℃，12 000 ×g，離心15 min。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質，然后將其轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶封閉PVDF膜，并用TBST溶液洗滌3次，每次5 min/次。一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜。洗滌后在室溫下與二抗（1∶5 000）孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光液曝光。使用GAPDH作為內參。

1.8 統計學方法實驗結果數據以均數±標準差表示，SPSS 19.0軟件對數據進行統計學處理。IC50計算采用概率分析法，組間多樣本均數比較采用ONE WAY ANOVA進行分析，P ＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 芍藥苷和替莫唑胺對原代腦膠質瘤細胞活力的影響結果如圖1示，替莫唑胺和芍藥苷單藥對原代腦膠質瘤細胞的生長均具有抑制作用，并且其抑制作用呈劑量和時間依賴性。作用24、48 h后替莫唑胺的IC50值分別是404.15、191.57 μmol/L。作用24、48 h后芍藥苷的IC50值分別是96.79、69.85 μmol/L。兩藥聯合等效圖結果顯示，替莫唑胺與芍藥苷聯合應用時，對原代腦膠質瘤細胞的生長抑制作用明顯增強。與6.25、12.5、25 μmol/L的芍藥苷聯合應用處理后，替莫唑胺的IC50值分別為159.68、107.84、65.54 μmol/L，較單獨應用時的IC50明顯降低（P ＜0.05）。等效線圖分析顯示，芍藥苷聯合替莫唑胺的CI值明顯小于1，在芍藥苷濃度為6.25、12.5、25 μmol/L時CI值分別為0.96、0.82、0.86提示兩藥聯合呈明顯協同作用。

圖1 芍藥苷協同替莫唑胺抑制對膠質瘤細胞活力Fig.1 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the cell viability of glioma cells

2.2 芍藥苷協同替莫唑胺抑制腦膠質瘤細胞增殖采用EdU增殖染色法檢測不同處理對原代腦膠質瘤膠質瘤細胞增殖能力的影響，如圖2A所示，圖中藍色的細胞（Hoechst 33342）代表所有細胞的細胞核，紅色的細胞（EdU）代表增殖細胞。統計分析發(fā)現，與對照組比，芍藥苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和兩藥聯合組（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）均能抑制原代腦膠質瘤的增殖能力（P ＜0.05）。與芍藥苷和替莫唑胺單藥相比較，兩藥聯合對原代腦膠質瘤細胞的增殖抑制作用更強（P ＜0.05）。EdU染色結果與MTS結果一致，提示芍藥苷協同替莫唑胺抑制原代腦膠質瘤膠質瘤細胞增殖。

2.3 芍藥苷協同替莫唑胺抑制腦膠質瘤細胞遷移分別用不同處理原代腦膠質瘤細胞16 h后，采用Transwell細胞遷移實驗檢測原代腦膠質瘤細胞的遷移能力，如圖2C所示，對照組、芍藥苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和兩藥聯合組（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）每視野的遷移細胞數分別為196.7 ± 14.5、98.0 ± 11.5、65.0±14.5、43.6±6.02個。芍藥苷、替莫唑胺和兩藥聯合組均能抑制原代膠質瘤細胞的遷移能力（P ＜0.05）；與芍藥苷和替莫唑胺單藥相比較，兩藥聯合對原代腦膠質瘤細胞遷移抑制作用更強（P ＜0.05）。

圖2 芍藥苷協同替莫唑胺抑制腦膠質瘤細胞的增殖和遷移Fig.2 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the proliferation and migration of glioma cells

2.4 反向藥效團對接技術提示Src 是芍藥苷治療膠質瘤的潛在作用靶點以Norm Fit大于0.95作為判定標準篩選反向對接結果，共對接出能與芍藥苷結合的62個潛在靶點。進一步排除非膠質瘤相關的作用靶點，最終獲得包括Src激酶在內的潛在靶點32個。然后通過STRING數據庫分析這些潛在靶點的相互作用，結果如圖3所示，Src蛋白處于較為靶點蛋白相互作用較為核心的位置。

圖3 芍藥苷治療膠質瘤潛在作用靶點相互作用Fig.3 The interaction of potential targets of paeoniflorin in the treatment of glioma

2.5 芍藥苷通過抑制Src/STAT3 信號通路協同替莫唑胺抑制腦膠質瘤細胞增殖和遷移采用Western blot檢測Src/STAT3信號通路的表達。結果如圖4所示，與對照組相比較，芍藥苷組（25 μmol/L）與替莫唑胺組（100 μmol/L）均能夠抑制增殖相關蛋白Cyclin D1、c-Myc以及遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達。與替莫唑胺組相比較，芍藥苷組顯著抑制p-Src和p-STAT3的表達。兩藥聯用（芍藥苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）能夠顯著抑制Src/STAT3信號通路的激活，并增強對Src/STAT3信號通路下游增殖以及遷移相關蛋白的抑制作用。

圖4 芍藥苷協同替莫唑胺對抑制腦膠質瘤細胞Src/STAT3 信號通路的影響Fig.4 Paeoniflorin united temozolomide inhibits Src/STAT3 signaling pathway in glioma cells

3 討論

腦膠質瘤是中樞神經系統（central nervous system，CNS）最常見的原發(fā)惡 性腫瘤，年發(fā)病率為5/10萬左右，多發(fā)于神經外胚層，約占顱內腫瘤的40%-50%，具有治愈率低、復發(fā)率高和病死率高的特點，患者預后不良［5］。目前對腦膠質瘤的治療手段集中在手術、放療與化療三個方面，但腦膠質瘤的治療效果仍不理想［6］。腦膠質瘤治療中，化療藥物的耐藥是腦膠質瘤治療失敗的主要原因之一，傳統的藥物如卡莫司汀、順鉑、替尼泊苷等臨床實際有效率僅20%左右［7］。

替莫唑胺是現今膠質瘤化療的首選藥物。替莫唑胺為咪唑并四嗪類新型烷化劑，具有抗膠質瘤活性，并自上市以來已經較為廣泛地應用于臨床膠質瘤治療［8-10］。國內外大型臨床試驗結果證明經替莫唑胺治療后，腦膠質瘤患者的平均存活期為13 ～32個月，明顯提高了生活質量，使用者的腦水腫癥狀得到減輕，腦腫瘤體積減小，而且未見因嚴重不良反應而終止治療的報道［11］。歐洲癌癥研究與治療組織和加拿大國家癌癥研究所臨床試驗小組進行的一項隨機Ⅲ期試驗發(fā)現，與單獨的放療相比，放療基礎上聯合替莫唑胺治療可改善膠質瘤患者的生存率［12］。另一項研究在老年（＞65歲）膠母細胞瘤患者中，短程放療聯合替莫唑胺，與單獨短程放療相比，能顯著延長患者的總生存期和無進展生存期［13］。盡管替莫唑胺顯示出一定的效果，但臨床上還存在著一定的局限性［14］。因此，有必要探討和研究聯合用藥以提高療效。

芍藥苷是一種水溶性單萜類糖苷化合物，普遍存在于毛茛科科植物中，是中藥赤芍、白芍和牡丹的主要有效成分。芍藥苷于1963年首次從芍藥中提取，化學分子式為C23H28O11，分子量為480.50［15］。研究發(fā)現芍藥苷具有多種藥理學作用，包括抗腫瘤、抗氧化應激、抗血小板聚集以及抗炎等。芍藥苷對多種腫瘤/癌癥（如神經膠質瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和白血?。┚哂辛己玫目鼓[瘤活性［16-17］。芍藥苷能夠通過抑制U87、U251、T98G膠質瘤細胞中TGF-β的表達，抑制上皮-間質轉化，從而增強細胞凋亡，減少細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制裸鼠皮下移植瘤的生長［18-20］。芍藥苷通過抑制膠質母細胞瘤中的HGF/c-Met/RhoA/ROCK信號通路來抑制細胞遷移和侵襲以及肌動蛋白的細胞骨架重排［21］。芍藥苷能通過抑制S-期相關蛋白2的表達而發(fā)揮抗膠質瘤細胞U87的作用［22］。芍藥苷通過microRNA-16上調和基質金屬蛋白酶-9下調抑制膠質瘤細胞增殖和誘導凋亡［23］。除了單獨作用抑制腫瘤細胞外，研究發(fā)現芍藥苷能夠協同多種抗腫瘤藥物抑制腫瘤。芍藥苷能夠協同順鉑促進caspase蛋白活性，誘導膀胱癌細胞凋亡，抑制膀胱癌細胞體內的生長，并能減少順鉑治療導致的小鼠體重下降［24］。芍藥苷能夠通過抑制核內NF-κB轉錄活性，下調抗凋亡相關基因Bcl-2的表達，協同奧沙利鉑促進結腸癌細胞凋亡［25］。本研究對芍藥苷協同替莫唑胺抑制膠質瘤作用進行研究，MTS結果顯示芍藥苷聯合替莫唑胺可明顯抑制原代腦膠質瘤細胞的增殖，其作用呈時間和劑量依賴性。進一步等效線圖分析顯示，芍藥苷聯合替莫唑胺的CI值明顯小于1，結合EdU染色結果，進一步提示芍藥苷協同替莫唑胺能夠顯著抑制膠質瘤細胞的體外增殖。Transwell遷移實驗結果則提示，芍藥苷協同替莫唑胺顯著抑制膠質瘤細胞的遷移。以上結果提示芍藥苷能夠有效地協同替莫唑胺抑制膠質瘤細胞增殖和遷移，提高替莫唑胺對膠質瘤細胞的抑制作用并降低其給藥濃度。

為了探索芍藥苷協同替莫唑胺抑制膠質瘤細胞增殖與遷移的作用機制，本研究采用反向藥效團對接技術尋找能與芍藥苷發(fā)生結合的潛在蛋白。反向藥效團對接技術是根據化學成分結構尋找靶蛋白的技術，能夠為藥理活性實驗篩選靶蛋白，極大地提高對中藥有效成分的作用機制研究的效率［26］。芍藥苷的對接結果發(fā)現了包括Src在內的32個潛在靶點。Src是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，是由原癌基因c-Src編碼的一個相對分子質量為60 kd的蛋白質。Src廣泛存在于組織細胞中，參與細胞的生長、發(fā)育和分化等過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯系［27］。既往研究發(fā)現與正常腦組織相比，膠質瘤組織標本中Src的磷酸化水平顯著升高，同樣地多種膠質瘤細胞系（T98G和U87）中也能觀察到Src活性升高［28-30］。使用siRNA阻斷Src能夠增加替莫唑胺對膠質瘤的細胞毒性作用，抑制膠質瘤生長和增殖［31］。作為一種非受體酪氨酸激酶，活化的Src能夠激活信號轉導和轉錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）［32］。激 活 后 的STAT3與Src同源蛋白2結構域相互作用而發(fā)生二聚化，產生的胞質同源二聚體和異源二聚體并易位至細胞核，調控包括增殖、抗凋亡、遷移、侵襲與血管新生在內的靶基因的轉錄，從而促進膠質瘤生長、侵襲和轉移［33］。使用STAT3抑制劑能夠抑制抑制STAT3下游Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表達，抑制膠質瘤細胞體外增殖和遷移，抑制體內移植瘤的生長［34］。本研究發(fā)現芍藥苷具有抑制Src/STAT3信號通路作用，能夠顯著抑制p-Src以及p-STAT3的表達水平，與替莫唑胺聯用能夠進一步增強對增強對Src/STAT3信號通路下游增殖相關靶蛋白CyclinD1和c-Myc以及遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9的抑制，增強抑制原代腦膠質瘤細胞增殖和遷移的作用。

綜上所述，本研究的結果表明芍藥苷通過抑制Src/STAT3信號通路，協同替莫唑胺抑制原代腦膠質瘤細胞的增殖和遷移，為芍藥苷聯合替莫唑胺藥物組合應用于治療腦膠質瘤提供了實驗依據。