張芳雍 譚國鉗 曾裕文 吳帆

暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院肝膽外科（廣州510220）

Mus81（甲磺酸鹽及紫外線敏感性81號基因）是近年來發(fā)現的一種DNA修復基因，在維持細胞基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的生物學功能［1-2］，因而曾被認為是一個腫瘤抑制基因［3］。然而最近的研究發(fā)現，Mus81的生物學功能具有多樣性，也可發(fā)揮促進腫瘤發(fā)展的作用［4］。YIN等［5］研究就發(fā)現Mus81可通過調控上皮間質轉化（EMT）促進胃癌細胞系的遷移。筆者前期研究也發(fā)現，Mus81沉默可逆轉人肝癌和結腸癌細胞系的化療耐藥性［6-7］，并可抑制人結腸癌細胞系HCT116的增殖、促進其凋亡［8］，提示Mus81可能是一個潛在的腫瘤治療靶點，但Mus81在人肝癌細胞系增殖凋亡中的作用尚未明確。為此，本研究以慢病毒介導的小干擾RNA（siRNA）沉默人肝癌細胞系Hep3B中Mus81基因的表達，觀察Mus81對肝癌細胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料Hep3B肝癌細胞系、siRNA慢病毒載體GV248、293T細胞、包裝質粒pGC-LV、pHelper1.0和pHelper2.0均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；實時定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司（TP800）；MTT試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；Giemsa染液購自美國chemicon公司；凋亡試劑盒購自美國Ebioscience公司；碘化丙錠（PI）染色試劑盒購自德國Sigma公司。

1.2 慢病毒介導的siRNA設計針對Mus81基因的短發(fā)卡RNA（shRNA）序列如下（由上海吉凱基因化學技術有限公司合成）：正義鏈：5′-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGAT -CCAGTACCAACTCTTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3′；陰性對照序列為：正義鏈：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTTCTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。將上述shRNA序列形成的DNA雙鏈與siRNA慢病毒質粒GV248連接，再利用Lipofectamine 2000將上述質粒分別與pGC-LV、pHelper1.0和pHelper 2.0慢病毒包裝載體共轉染至293T細胞，生成Mus81-siRNA和及陰性對照慢病毒。將感染上述2種慢病毒的肝癌Hep3B細胞系分別命名為Mus81-siRNA組（實驗組）和siRNA-NC組細胞（陰性對照組）。感染3 d后采用熒光倒置顯微鏡（micropublisher 3.3RTV，日本奧林帕斯公司）觀察兩組細胞的慢病毒感染效率。

1.3 qRT-PCR 檢測Mus81 基因干擾效率根據Invitrogen公司的Trizol操作說明書提取Mus81-siRNA組和siRNA-NC組細胞的總RNA，在熒光定量PCR儀行PCR檢測，反應條件為：95 ℃預變性15 s，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進行45個循環(huán)。Mus81基因引物：上游引物：5′-CTACAGCACTTCGGAGACG-3′；下游引物：5′-GGTAGAGCACCAGCAGTATCA-3′。內參管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物：上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。采用2-ΔΔCT法分析Mus81基因表達水平。

1.4 MTT檢測將處于對數生長期的Mus81-siRNA組和siRNA-NC組細胞經胰酶消化后重懸成細胞懸液，以2 000個細胞/孔接種于96孔板，每組設5個復孔。鋪板后置37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于第2天開始每孔加入10 μL的MTT（5 mg/mL），無需換液。于檢測前4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）終止反應，酶標儀490 nm檢測吸光度（OD）值，繪制兩組Hep3B細胞系的生長曲線。

1.5 細胞克隆形成檢測兩組細胞以800個細胞/孔接種于6孔板培養(yǎng)板中，每個實驗組設3個復孔，將接種細胞培養(yǎng)到14 d，中途每隔3 d進行換液。實驗終止時磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞1次后每孔加入1 mL多聚甲醛，固定細胞30 ～60 min，PBS再次洗滌后加入GIEMS染液500 μL，染色20 min。ddH2O洗細胞至洗凈板上背景，克隆計數。

1.6 細胞凋亡檢測取兩組細胞于5 mL離心管中，每組設三個復孔，以1×binding buffer洗滌細胞，1 500 r/min離心5 min后收集細胞。以1 × staining buffer重懸細胞后取細胞懸液100 μL（1 × 105細胞），加入5 μL annexin V-APC染色，室溫避光10 ～15 min，轉移至流式上機管中行流式細胞檢測。

1.7 細胞周期檢測收集兩組細胞于5 mL離心管中，每組設三個復孔，4 ℃預冷的PBS洗滌細胞沉淀1次，1 500 r/min離心5 min，收集細胞于4 ℃預冷的70%乙醇固定細胞2 h。以1 500 r/min離心5 min去固定液，PBS洗滌細胞沉淀一次，加入PI染色液重懸細胞沉淀，上機行流式細胞檢測。

1.8 統計學方法應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用Student′s t檢驗。生長曲線采用重復測量資料的方差分析。所有分析均為雙側檢驗，P ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Mus81 干擾效率熒光顯微鏡下觀察Mus81-siRNA和siRNA-NC兩組細胞慢病毒感染效率均高于80%。qRT-PCR檢測Mus81沉默后Hep3B細胞發(fā)現Mus81-siRNA組Mus81基因的表達水平僅為siRNA-NC組的23.58%［（0.236 ± 0.008）vs.（1.001± 0.059），t = 14.977，P ＜0.001］，即Mus81基因干擾效率為76.42%，見圖1。

2.2 Mus81 沉默對Hep3B 細胞生長的影響MTT法繪制出的生長曲線提示Mus81-siRNA組的生長速度明顯低于siRNA-NC組（F=2 056.758，P ＜0.001），見圖2。

2.3 Mus81 沉默對Hep3B細胞增殖能力的影響平板克隆形成實驗顯示，Mus81-siRNA組Hep3B細胞形成的克隆數量明顯少于siRNA-NC組［（2±1）vs.（54±3），t=29.133，P ＜0.001］，見圖3。

圖1 慢病毒感染Hep3B 細胞的感染效率及干擾效率Fig.1 Infection efficiency and interference efficiency of lentivirus infected Hep3B cells

圖2 MTT 檢測結果Fig.2 Results of MTT test

2.4 Mus81 沉默對Hep3B 細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，Mus81-siRNA組Hep3B細胞的凋亡率是siRNA-NC組細胞的30.25倍［（20.87 ±0.82）%vs.（0.69±0.09）%，t=-42.543，P ＜0.001］，見圖4。

2.5 Mus81沉默對Hep3B細胞周期的影響Mus81-siRNA組細胞的G1、S和G2/M期細胞比例分別為（33.77±1.61）%、（36.96±3.09）%和（29.27±2.64）%，siRNA-NC組分別為（42.06±0.40）%、（33.84±0.88）%和（24.10 ± 0.50）%。Mus81-siRNA組G1期細胞比例低于siRNA-NC組（t = 8.657，P ＜0.05），而兩組間S和G2/M期細胞比例差異無統計學意義（P ＞0.05］，見圖5。

3 討論

圖3 平板克隆形成實驗結果Fig.3 Results of plate clone formation experiment

圖4 Annexin V-APC 染色法檢測結果Fig.4 Results of Annexin V-APC staining method

圖5 細胞周期分布結果Fig.5 Results of cell cycle distribution

肝癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，高居我國惡性腫瘤病死率的第二位［9］。盡管肝癌的手術治療及靶向藥物等取得了很大的進步，但其長期存活率仍不能令人滿意［11-12］。而篩選潛在的肝癌治療靶點可能是提高肝癌治療療效、改善患者預后的關鍵［13-14］。許多研究表明，DNA修復基因與肝癌的易感性和預后密切相關［15］，而靶向抑制這些DNA修復基因可作為肝癌的潛在治療策略［16-17］。Mus81是定位于人11號染色體長臂的DNA修復基因，屬于核酸內切酶超家族，在同源重組修復和非同源末端鏈接過程中發(fā)揮極其重要的作用。MCPHERSON等［3］發(fā)現Mus81基因敲除的小鼠中可自發(fā)淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤，據此曾認為Mus81是一個腫瘤抑制基因。但YIN等［5］新近的研究結果顯示Mus81可通過調控上皮間質轉化（EMT）而促進胃癌細胞的遷移。而吳云路等［18］的研究則發(fā)現Mus81過表達可抑制SKBR3乳腺癌細胞系的增殖能力并降低該細胞系的侵襲遷移能力。筆者前期的研究也發(fā)現Mus81基因沉默后可抑制人結腸癌細胞系HCT116的生長并促進其凋亡［8］，且敲減Mus81基因可逆轉人肝癌和結腸癌細胞系的化療耐藥性［6-7］，提示其是一個潛在的腫瘤治療靶點。上述研究提示Mus81在惡性腫瘤中的作用存在多樣性和差異性，在部分腫瘤中發(fā)揮著促癌作用，但其在肝癌增殖凋亡中的作用尚未明確［19］，還有待于進一步研究。

本研究首先采用慢病毒介導的siRNA構建沉默Mus81的Hep3B人肝癌細胞系，熒光顯微鏡觀察結果顯示Mus81敲減慢病毒的細胞感染效率高于80%，qRT-PCR檢測結果顯示Mus81基因干擾效率高達76.42%，提示該慢病毒感染和敲減Mus81的效果均很理想，Mus81基因敲減的Hep3B肝癌細胞系已構建成功。為進一步研究Mus81沉默對Hep3B肝癌細胞生物學功能的影響，采用MTT法對Hep3B細胞的生長情況進行檢測，結果顯示Mus81-siRNA組的生長速度明顯低于siRNA-NC組，且Mus81-siRNA組細胞的增殖倍數在每個檢測時間點上均低于siRNA-NC組，提示Mus81基因沉默抑制了Hep3B肝癌細胞系的增殖，這與筆者前期研究在HCT116結腸癌細胞系中得到的結果相一致［8］，提示Mus81確實可促進腫瘤細胞的生長。但最近YIN等［5］的研究則發(fā)現Mus81沉默對SGC7901和BGC823胃癌細胞系的生長沒有明顯的影響，提示Mus81沉默對不同的惡性腫瘤細胞的生長具有不同的影響，推測這可能與Mus81在不同惡性腫瘤中的功能存在差異性有關，就如同目前的研究發(fā)現Mus81可促進胃癌細胞的遷移卻抑制乳腺癌細胞的侵襲遷移一樣［5，18］，但這尚待進一步研究。

為探索Mus81沉默抑制Hep3B肝癌細胞生長的機制，采用平板克隆形成實驗檢測Mus81敲減對Hep3B細胞增值能力和凋亡水平的影響，結果顯示Mus81-siRNA組細胞形成的克隆數明顯少于siRNA-NC組，僅為后者的3.70%，提示Mus81沉默可明顯抑制Hep3B肝癌細胞系的增殖能力，這可能也是Mus81沉默導致Hep3B肝癌細胞生長速度下降的原因之一。鑒于細胞周期的阻滯也可導致細胞生長速度的降低，采用流式細胞儀檢測了兩組Hep3B細胞的細胞周期分布，結果顯示Mus81-siRNA組Hep3B細胞中G1期細胞比例低于siRNANC組，而S和G2/M期細胞比例則無明顯差異，提示Mus81沉默可引起Hep3B肝癌細胞系G2/M期阻滯，這與既往研究中發(fā)現Mus81沉默可引起HCTll6結腸癌細胞系輕微G2/M期阻滯的結果一致［8］，不僅進一步證明Mus81的確參與了G2/M期的調控，也提示Mus81沉默導致的G2/M期阻滯可能是其抑制Hep3B細胞生長的原因之一。但考慮到Mus81沉默導致的G2/M期阻滯的程度并不足以解釋其對Hep3B細胞生長增殖能力的抑制，我們也分析了Mus81沉默對Hep3B細胞凋亡的影響，結果發(fā)現Mus81-siRNA組的細胞凋亡率明顯高于siRNANC組，是后者的30.25倍，這與既往研究中HepG2、SMMC-7721肝癌細胞系和HCTll6結腸癌細胞系的結果一致［8，19］，顯示促進細胞凋亡可能是Mus81沉默抑制Hep3B肝癌細胞生長的重要原因。既往研究通過實時定量PCR檢測Mus81敲減組HCT116結腸癌細胞系中凋亡相關基因的表達，發(fā)現Mus81可能通過調控Bax、Bcl-2和p53等凋亡相關基因的表達而促進結腸癌細胞凋亡［8］。STC2基因可在Mus81介導下調控肝癌細胞的增殖和凋亡［19］。Mus81是否通過上述信號通路或其他信號通路實現其對Hep3B肝癌細胞系增殖凋亡的調控目前尚不清楚，仍有待進一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現Mus81基因沉默可明顯抑制Hep3B肝癌細胞系的生長增殖并促進其G2/M期阻滯及凋亡，提示Mus81是一個潛在的肝癌治療靶點。