鄭唐輝 薛同春

（1 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，福建 廈門 361015；2 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤內(nèi)科，上海 200032）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高致死性的惡性腫瘤之一，其在全球腫瘤致死性病因中排名第4位[1]。目前盡管有外科切除、介入、化療、口服靶向藥物、免疫抑制劑等治療方法，但由于對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍不十分明確，使其5年總體生存率仍不到20%[2]。因此，探索潛在的促癌基因靶點(diǎn)對(duì)指導(dǎo)HCC的臨床治療具有顯著必要性。

多梳蛋白SUZ12（suppressor of zeste 12）是由人類SUZ12 基因所編碼的蛋白質(zhì)，近年來該編碼基因備受關(guān)注。正常情況下，SUZ12基因與EED基因（embryonic ectoderm development）及EZH1/2基因（enhancer of zeste homolog 1 or 2）協(xié)同參與染色質(zhì)形成、基因表達(dá)及干細(xì)胞分化等，該作用貫穿于果蠅到人類等物種的全生命周期[3]。目前，已發(fā)現(xiàn)SUZ12的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后密切相關(guān)[4-5]，然而在原發(fā)性肝癌中的研究仍缺乏足夠的報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測SUZ12蛋白在HCC中的表達(dá)情況，著重探索其與原發(fā)性肝癌患者的臨床預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院隨機(jī)提供于2007年11月至2008年6月手術(shù)切除的肝血管瘤正常肝組織27例，原發(fā)性肝癌標(biāo)本88例及相應(yīng)的癌旁組織。肝癌患者中，其中男性71例，女性17例；年齡24～79歲，平均年齡（53.47±6.52）歲；臨床病例分期按美國聯(lián)合癌癥委員會(huì)（AJCC）法：Ⅰ期42例，Ⅱ期20例，Ⅲ期26例，Ⅳ期0例。所有患者術(shù)前均無肝外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、放療、化療或其他輔助性治療。全部標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為HCC，并用10%福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋。

1.2 主要試劑 兔抗人SUZ12單克隆抗體購買自美國Proteintech公司。工作溶度按1∶40的體積溶度進(jìn)行稀釋；山羊抗兔免疫組織化學(xué)染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、一抗稀釋液、檸檬酸緩沖液（抗原修復(fù)液）、PBS、蓋玻片均購自上海生物科技公司。其余實(shí)驗(yàn)器材和常規(guī)試劑均為實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配制。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制備 含有88例人HCC，27例正常肝組織。組織芯片由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科按科室建立的技術(shù)平臺(tái)制備，組織芯片直徑1.0 mm，石蠟切片厚5 μm。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測 組織芯片常規(guī)脫蠟、水化，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=6.0）微波抗原修復(fù)，0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉。兔抗人SUZ12抗體按1∶40稀釋后作為第一抗，山羊抗兔抗體作為第二抗進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色。最后常規(guī)脫水、透明、干燥、封片、鏡檢、拍照。

1.3.3 結(jié)果判定 由Pannoramic MIDI掃描儀（3D HISTECH公司）對(duì)組織芯片進(jìn)行圖像采集，應(yīng)用配套軟件densito quant自動(dòng)分析出強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性及陰性的面積（單位：像素）、陽性的百分比，并自動(dòng)計(jì)算H-score評(píng)分。其中H-Score=0～1為陰性及1～50分為弱陽性（低表達(dá)組）；51～100分為陽性及101～300分為強(qiáng)陽性（高表達(dá)組），上限為300分。

1.4 隨訪 所有患者術(shù)后均進(jìn)行定期隨訪，隨訪時(shí)間為患者接受手術(shù)的時(shí)間，隨訪截止時(shí)間為2015年7月1日。采用門診隨訪及電話隨訪結(jié)合的方式，平均每3個(gè)月隨訪1次。對(duì)死亡患者其死亡時(shí)間即為終止時(shí)間。中途失訪2例，其終止時(shí)間為最后1次隨訪時(shí)間，中途失訪患者亦納入生存分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，SUZ12的表達(dá)于臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的相關(guān)性用Chi-square檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)，組間差異分析用t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存分析用Log-rank檢驗(yàn)；單因素及多因素生存分析用Cox回歸分析檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SUZ12的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在本研究中的SUZ12在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)陽性率分別為89.24%和56.65%。其中肝癌組織中低表達(dá)30例（34.09%），高表達(dá)58例（65.91%）；正常組織均為低表達(dá)。PBS染色均未發(fā)現(xiàn)特殊染色（圖1）。

圖1 SUZ12在肝癌組織中的表達(dá)情況（×400）

2.2 SUZ12的表達(dá)與肝癌臨床病理因素的關(guān)系 Chi-square及Fisher檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SUZ12高表達(dá)與肝硬化存在負(fù)相關(guān)（P=0.043），且與HBsAg攜帶狀態(tài)（P=0.089）存在正相關(guān)趨勢，而與患者的性別（P=0.209）、年齡（P=0.541）、甲胎蛋白（P=0.134）、腫瘤大?。≒=0.306）、腫瘤數(shù)目（P=0.832）、血管侵犯（P=0.759）、分化程度（P=0.728）、AJCC（P=0.557）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 生存分析

2.3.1 Kaplan-Meier生存分析 對(duì)88例肝癌患者術(shù)后的生存資料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析顯示：SUZ12低表達(dá)者的平均生存時(shí)間為75.70個(gè)月，中位生存時(shí)間為106.00個(gè)月；高表達(dá)者的平均生存時(shí)間為50.50個(gè)月，中位生存時(shí)間為26.00個(gè)月。隨著SUZ12標(biāo)的升高，患者的生存時(shí)間明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.212，P=0.022）（圖2）。

2.3.2 Cox回歸分析 對(duì)所有與臨床病理指標(biāo)進(jìn)行單因素Cox回歸分析，將其影響生存率的因素再進(jìn)行多因素回歸分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：SUZ12高表達(dá)是肝癌患者生存的危險(xiǎn)因素，SUZ12陽性表達(dá)可以作為肝癌患者的生存預(yù)測因子（P=0.009）。并且腫瘤＞5 cm（P=0.020）、低分化（P=0.037）及AJCC分期（P＜0.001）也是肝癌患者獨(dú)立的不良生存預(yù)測因子（表2、3）。

3 討 論

近年來，盡管索拉菲尼、侖伐替尼等抑制血管生成靶向藥物以及PD-1、PD-L1、CTL-A4等免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，使得肝癌的5年生存率有所提高，但療效仍十分有限[6]。這主要是由于惡性腫瘤隨著時(shí)間推移多數(shù)都會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，最終將患者推向終末階段。SUZ12基因高度保守，廣泛存在于從果蠅到包含人類的多種哺乳動(dòng)物中，在維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控細(xì)胞生命周期、引導(dǎo)干細(xì)胞分化、促進(jìn)胚胎發(fā)育等方面有著決定性的作用[7]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，SUZ12基因的異常表達(dá)可直接或間接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Hu 等[8]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者若出現(xiàn)TRPS1缺失，則可增強(qiáng)SUZ12的表達(dá)活性并進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

表1 肝癌組織中SUZ12的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系（例）

圖2 SUZ12高表達(dá)組與低表達(dá)組Kaplan-Meier生存分析

SUZ12在肝癌中的相關(guān)研究大部分仍局限于動(dòng)物模型或肝癌細(xì)胞株，且存在一定的爭議。Kirmizis等[9]曾在早期發(fā)現(xiàn)，SUZ12在小鼠肝癌模型中的mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，并推測SUZ12是治療惡性腫瘤的潛在靶點(diǎn)。Liu 等[10]進(jìn)一步確認(rèn)SUZ12蛋白在多種肝癌細(xì)胞癌株中不同程度的表達(dá)上調(diào)，并通過EZH2/PAK6信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)肝癌的增殖、遷移和侵襲。上述關(guān)于SUZ12在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平與本研究結(jié)果比較一致。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，SUZ12在HCC患者中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織。表明SUZ12的異常高表達(dá)可能參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步的生存分析發(fā)現(xiàn)，SUZ12的表達(dá)升高可顯著降低肝癌患者的預(yù)期生存時(shí)間，多因素分析提示SUZ12是肝癌患者獨(dú)立的預(yù)測生存因子。2019年，Xue 等[11]的研究顯示SUZ12在乙型肝炎相關(guān)性肝細(xì)胞中表現(xiàn)為高表達(dá)，該結(jié)果與本研究有所差異。推測SUZ12在肝癌的不同發(fā)展階段可能有不同的表現(xiàn)。本研究結(jié)果提示，SUZ12的表達(dá)隨著AJCC分期越晚，其表達(dá)水平越高。目前已知原發(fā)性肝癌是一種高度異質(zhì)性惡性腫瘤，其體積大小、血管侵犯、細(xì)胞分化等都可能與SUZ12內(nèi)在互相調(diào)控機(jī)制相關(guān)。本研究內(nèi)容仍存在一定的局限性，關(guān)于SUZ12在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討，如SUZ12在肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中是否起潛在調(diào)控作用等問題仍需更多的臨床資料及試驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 Cox單因素模型參數(shù)估計(jì)

表3 Cox多因素模型參數(shù)估計(jì)

綜上所述，SUZ12蛋白在HCC中具有較高的表達(dá)率，其可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并且SUZ12蛋白的表達(dá)水平可作為判斷肝癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。