李雪芹，焦艷曉，李興隆，彭 游

(九江學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西省生態(tài)化工工程技術(shù)研究中心，江西 九江 332005)

大豆異黃酮是大豆等多種植物中的一種重要代謝產(chǎn)物，因具有廣泛的生理活性而備受關(guān)注。大豆異黃酮包括染料木素、大豆苷元(Daidzein，DD,4′,7-二羥基異黃酮)、黃豆黃素及其苷類[1]，在結(jié)構(gòu)上與17-雌二醇相似，能夠通過與雌激素受體結(jié)合表現(xiàn)出雌激素行為。其中，DD作為大豆異黃酮中的主要活性成分，近年來成為科學(xué)家們研究的熱點。DD具有抗炎，抗氧化，預(yù)防骨質(zhì)疏松、癌癥、心血管疾病以及抗動脈粥樣硬化等多種生理活性[2-6]。但是，由于在4′-位和7-位兩個羥基極性基團的作用下，DD易形成分子間氫鍵，從而導(dǎo)致水溶性差，生物利用度低，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。為了提高其生物利用度和活性，本課題組以DD為先導(dǎo)化合物，根據(jù)藥動基團變換原理進行結(jié)構(gòu)修飾，合成了3個大豆苷元苯磺酸酯類衍生物(D1～D3，圖1)，以期通過結(jié)構(gòu)改造從根本上改善其藥學(xué)性質(zhì)，增強其抗動脈粥樣硬化等方面的生物活性[7-9]。

圖1 大豆苷元衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of daidzein derivatives

體外代謝研究可在新藥研發(fā)早期利用體外代謝參數(shù)合理預(yù)測候選化合物的體內(nèi)藥動學(xué)行為，指導(dǎo)后期藥效、藥動以及安全性評價的模型選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景[10-12]。利用細胞對藥物進行體外代謝研究可以排除體內(nèi)多種因素的干擾，為整體實驗提供可靠的理論依據(jù)[10]。本課題組前期利用人主動脈血管平滑肌細胞(HAVSMCs)研究了大豆苷元衍生物D1～D3體外吸收與構(gòu)性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大豆苷元衍生物的細胞吸收均遠高于先導(dǎo)物DD[13-14]。本文進一步采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS)研究大豆苷元衍生物在HAVSMCs中的代謝成分，推測其體外代謝路徑，為衍生物體內(nèi)吸收代謝提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6430 Triple Quadrupole LC-MS，TG18-WS型湘立臺式高速離心機，Hair超低溫冰箱,DN-24A型氮吹儀，美國ESCO CO2培養(yǎng)箱，日本Olympus倒置生物相差顯微境。

大豆苷元苯磺酸酯衍生物D1～D3由本實驗室合成[7-9];青霉素鏈霉素混合液購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司，生物級二甲亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich中國公司;南美胎牛血清購自依科賽(Excell bio)生物科技(太倉)有限公司,DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。HAVSMCs購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。其余試劑為化學(xué)純或分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與藥物處理參照文獻[13]、[14]所述方法，對凍存管的HAVSMCs進行復(fù)蘇，取傳代為3～10代的HAVSMCs以105密度接種于6孔板，每孔2 mL。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁;更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。棄去上清液，分別加入含有不同藥物濃度的10%血清DMEM培養(yǎng)液，空白細胞組則加入等量的不含藥物的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后終止培養(yǎng)，分別收集細胞培養(yǎng)上清液，于-80 ℃冰箱冷凍保存。用PBS洗滌細胞3次，將6孔板置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 HPLC-MS分析條件色譜條件：流動相為甲醇-乙酸(0.1%)溶液(1 ∶1，體積比)，流速為0.5 mL/min，進樣量為10 μL。檢測波長λ=254 nm,柱溫25 ℃。

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿串聯(lián)精密質(zhì)譜儀，配有電子電離源，負離子模式測定。全質(zhì)譜數(shù)據(jù)在m/z50～1 000范圍獲得，最佳質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細管電壓4.0 kV，進樣錐電壓35 V，去溶劑化氣流(N2)速率900 L/h，進樣錐氣流(N2)速率50 L/h，去溶劑溫度50 ℃，離子源溫度150 ℃，誘導(dǎo)碰撞解離(CID)模式下的碰撞氣體采用高純氦氣，進氣壓力設(shè)為40 psi(275 800 Pa)，標準品的CID碰撞能為5～35 eV，裂解電壓為135 V。

1.2.3 細胞上清液成分測定將藥物作用的細胞上清液解凍，渦旋0.5 min，靜置。取細胞上清液50 μL置于2 mL離心管中，再加入50 μL甲醇，渦旋1 min。加入100 μL 0.4%磷酸二氫銨、1 mL乙酸乙酯，渦旋3 min。以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液950 μL，N2氣吹干，加入500 μL甲醇，渦旋0.5 min。過0.45 μm有機膜后進行HPLC-MS分析。

1.2.4 細胞裂解液成分測定將用6孔板培養(yǎng)的細胞從-80 ℃冰箱中取出，常溫解凍，每孔加入解凍好的細胞裂解液(給藥細胞裂解后的溶液)1 mL，超聲2 min，取0.5 mL置于2 mL離心管中，加入50 μL甲醇、100 μL 0.4%磷酸二氫銨、1 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，以3 000 r/min離心10 min。吸取上清液950 μL，用N2吹干，加入500 μL甲醇，渦旋0.5 min。過0.45 μm有機膜后，進行HPLC-MS分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)獲取和加工的質(zhì)譜軟件包括Mass Hunter Acquisition B.03.01、Qualitative Analysis B.03.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物D1的細胞代謝途徑

化合物D1與細胞共孵48 h后的細胞裂解液經(jīng)HPLC-MS分析后，通過軟件Qualitative Analysis B.03.01提取特定分子色譜圖解析，經(jīng)與空白對照樣品的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)8個原藥和代謝產(chǎn)物峰，并獲得這些代謝物的相對分子質(zhì)量，見表1。在化合物D1的細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)8個離子峰([M-H]-)：393.1、471.1、473.1、 429.3、 375.1、 253.4、434.8、294.9?；衔顳1細胞裂解液的總離子色譜圖與部分代謝物質(zhì)譜圖見圖2，其上清液中代謝物成分與細胞裂解液一致。

表1 D1體外代謝成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Mass spectrum data of D1 metabolites in vitro

圖2 化合物D1細胞裂解液的總離子色譜圖及部分代謝物質(zhì)譜圖Fig.2 The total ion chromatogram of cell lysate spiked with D1 and mass spectrogram of partial metabolites the numbers were the same as those in Table 1

由細胞裂解液的液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),化合物D1的細胞代謝途徑可能為化合物進入細胞后，水解脫去乙?；纱x產(chǎn)物M3?；蛘呦让撊ケ交酋；苫衔颩2，化合物M2在二磷酸尿苷(UDP)-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與細胞內(nèi)的葡萄糖醛酸結(jié)合生成葡萄糖醛酸苷M7。代謝物M2、M3在磺基轉(zhuǎn)移酶作用下，分別發(fā)生硫酸化反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物M4、M5。同時，化合物M2和M3 都可以進一步水解生成大豆苷元DD，DD在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與細胞內(nèi)葡萄糖醛酸苷結(jié)合，生成葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物M6或M6A?；衔顳1的細胞代謝途徑見圖3。

圖3 D1的HAVSMCs體外代謝途徑Fig.3 The metabolism pathway of D1 in HAVSMCs

2.2 化合物D2的細胞代謝途徑

化合物D2與細胞共孵48 h后的細胞裂解液經(jīng)HPLC-MS分析，通過軟件Qualitative Analysis B.03.01提取特定分子色譜圖解析,并與空白對照樣品的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)4個代謝產(chǎn)物峰，并獲得了這些代謝產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，見表2。在化合物D2的細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)代謝物分子離子峰([M-H]-)：429.3、253.2、443.2、266.9?；衔顳2細胞裂解液的總離子色譜圖和部分代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖見圖4?；衔顳2細胞上清液中的代謝物成分與細胞裂解液一致。

表2 D2體外代謝成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Mass spectrum data of D2 metabolites in vitro

由D2體系細胞裂解液的液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：化合物D2的細胞代謝途徑可能為化合物進入細胞后，在水解酶的作用下，水解脫去苯磺?；苫衔颩8?；衔颩8進一步水解生成大豆苷元DD，DD和M8分別與細胞內(nèi)葡萄糖醛酸苷結(jié)合，并分別生成葡萄糖醛酸苷M6(M6A)和M9。在體系中未發(fā)現(xiàn)D2先進行甲基醚水解的化合物，表明在細胞內(nèi)水解酶的作用下苯磺酸酯鍵比甲基醚鍵更易發(fā)生水解。化合物D2的細胞代謝途徑見圖5。

圖4 D2細胞裂解液的總離子色譜圖和部分代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.4 The total ion chromatogram of cell lysate spiked with D2 and mass spectrogram of partial metabolites the numbers were the same as those in Table 2

2.3 化合物D3的細胞代謝途徑

化合物D3與細胞共孵48 h后的細胞裂解液經(jīng)HPLC-MS分析，通過軟件Qualitative Analysis B.03.01提取特定分子色譜圖解析，并與空白對照樣品的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)6個代謝產(chǎn)物峰，并獲得了這些代謝物的相對分子質(zhì)量，見表3。在化合物D3的細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)離子峰([M-H]-)：361.2、473.0、457.2、429.3、253.2、281.3?；衔顳3細胞裂解液的總離子色譜圖與部分代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖見圖6。化合物D3上清液中的代謝物成分與細胞裂解液一致。

表3 D3體外代謝成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 3 Mass spectrum data of D3 metabolites in vitro

(續(xù)表3)

圖6 化合物D3細胞裂解液的總離子色譜圖和部分代謝成分質(zhì)譜圖Fig.6 The total ion chromatogram of cell lysate spiked with D3 and mass spectrogram of partial metabolites the numbers were the same as those in Table 3

根據(jù)細胞裂解液的液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：化合物D3的細胞代謝途徑可能有2條。一條代謝途徑為化合物進入細胞后，水解脫去苯磺酰基生成化合物M11,化合物M11分別發(fā)生硫酸化反應(yīng)和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)代謝成M13和M14。另一條代謝途徑為D3水解脫去乙基生成化合物M10，M10在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶作用下代謝成M12。而經(jīng)M10和 M11路徑均可進一步水解生成大豆苷元DD，DD與細胞內(nèi)葡萄糖醛酸苷結(jié)合，生成葡萄糖醛酸苷M6或M6A?；衔顳3的細胞代謝途徑見圖7。

體外細胞培養(yǎng)體系成分相對簡單，物質(zhì)明確，易于代謝途徑推斷和代謝物質(zhì)富集、分離、純化，有利于代謝物的進一步研究。本實驗對大豆苷元衍生物的HAVSMCs藥物代謝成分進行初步分析，發(fā)現(xiàn)在HAVSMCs內(nèi)，氧化還原酶活性不強，未發(fā)現(xiàn)D1～D3的氧化還原產(chǎn)物。但如表1～3,圖3、圖5、圖7所示，在各種細胞內(nèi)水解酶(比如脂肪酶)的作用下，D1～D3均發(fā)生了磺酸酯(乙酸酯)的水解和甲基(乙基)醚的水解生成相應(yīng)產(chǎn)物，最后水解均生成DD，表明體系中水解酶的活性較強，DD在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，羥基發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，生成大豆苷元單葡萄糖醛酸苷M6和/或M6A(m/z429.3)。但是并未發(fā)現(xiàn)大豆苷元的硫酸化產(chǎn)物，表明細胞中UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性較強。由于葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)和硫酸化反應(yīng)為競爭性反應(yīng)，在底物濃度較高時，一般會發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)[15]。而DD的兩個羥基并沒有全部葡萄糖醛酸苷化，可能是空間位阻的作用。根據(jù)圖3和圖7發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物M2、M11存在—OH，既能在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶作用下發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)生成M7(m/z471.1)和M14(m/z457.2)，又可在磺基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生硫酸化反應(yīng)分別生成代謝產(chǎn)物M4(m/z375.1)和M13(m/z361.2)，表明體系中磺基轉(zhuǎn)移酶也具有一定活性。當體系中底物濃度適中時，可以同時發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)和硫酸化反應(yīng)。

圖7 D3的HAVSMCs體外代謝途徑Fig.7 The metabolism pathway of D3 in HAVSMCs

3 結(jié) 論

本文對大豆苷元苯磺酸酯衍生物D1～D3的體外細胞代謝產(chǎn)物進行了初步研究。結(jié)果顯示，D1～D3在細胞內(nèi)的代謝路徑和代謝產(chǎn)物由其結(jié)構(gòu)特征所決定。大豆苷元苯磺酸酯衍生物的細胞代謝主要表現(xiàn)在水解、葡萄糖醛酸苷化和硫酸化?；衔顳2水解成DD只有一種可能的代謝路徑，代謝產(chǎn)物相對比較簡單，而其他兩種化合物D1、D3則可能經(jīng)歷兩種不同的代謝路徑生成先導(dǎo)物DD，代謝產(chǎn)物相對復(fù)雜且種類較多。實驗結(jié)果也表明，D1～D3均經(jīng)歷了完全水解為DD，進而與細胞內(nèi)葡萄糖醛酸苷結(jié)合生成葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物的過程。