陳婷婷，應(yīng)佚倫，崔凌飛，鐘誠兵，胡正利，顧 震，龍億濤*

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家 重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京 210023)

單個生物分子是影響和調(diào)控生命功能的基本單元之一，理解和研究單個生物分子可解析微觀尺寸下生命活動的基本特性[1-5]?，F(xiàn)有單分子檢測方法主要為原子力顯微鏡[6]、單分子熒光檢測技術(shù)[7]、掃描隧道顯微鏡[8]等?；谶@些方法，可以實現(xiàn)在單分子水平上對核酸(如DNA、RNA)及蛋白質(zhì)等生物大分子及其相互作用的檢測和分析。納米孔道分析技術(shù)作為一種基于納米孔道限域效應(yīng)的單分子測量技術(shù)[9-12]，具有通量高、尺寸小、無需標(biāo)記、無需真空環(huán)境、靈敏度高及成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被用于DNA分析[13-16]、RNA檢測[17-18]、蛋白質(zhì)識別[19-20]及單分子反應(yīng)研究等[21-24]。如利用野生型的Aerolysin納米孔道，不僅可以分辨長度為2到10個堿基的單個核苷酸，還可用于實時監(jiān)測核酸外切酶Ⅰ逐步裂解核酸的過程[25-26]。利用α-溶血素(α-Hemolysin,α-HL)納米孔道可檢測不同長度的類膠原肽以及區(qū)分其構(gòu)型，以進(jìn)一步實現(xiàn)混合體系中3種分析物的同時檢測[20]。納米孔道獲取納米尺度信息是基于對皮安級微弱電流和毫秒級時間分辨實現(xiàn)的。這種微弱電流信號的放大、快速獲取和高效儲存對納米孔道檢測儀器提出了巨大的挑戰(zhàn)：首先，儀器裝置需要極高的電流分辨(皮安級)[27]和極高的帶寬(>5 kHz)[28]，用于保證單分子信號測量的靈敏度和可靠性；其次，測量儀器需要穩(wěn)定性好、信噪比高，以及可在常規(guī)實驗室進(jìn)行單分子檢測操作；再者，樣品現(xiàn)場測量需要檢測設(shè)備體積小、便攜且對檢測環(huán)境無特殊要求。然而，現(xiàn)有的商品化電化學(xué)儀器均難以同時滿足以上3點(diǎn)。尤其是，儀器帶寬的提高往往意味著測量噪音的增加，而儀器體積較大不易于滿足現(xiàn)場納米孔道實驗的需求，且對防震臺、接地系統(tǒng)等條件的需求降低了納米孔道儀器裝置的普適性。因而，亟需一種新型的單分子檢測手段和通用型超靈敏儀器設(shè)備。

本課題組研制的Cube系列納米孔道儀器具有低噪音測量、集成化設(shè)計、高時間分辨率、高電流分辨的特點(diǎn)[29]，可實現(xiàn)對單個分子在納米孔道內(nèi)產(chǎn)生的微弱阻斷信號進(jìn)行高通量、高帶寬的實時采集，且儀器體積小巧，便于攜帶，適合多種檢測環(huán)境[28,30]。Cube系列納米孔道儀器的特點(diǎn)具體如下：(1)設(shè)計電阻反饋式的前置放大器電路，將微弱電流信號放大再轉(zhuǎn)換成較大的電壓信號，并傳輸?shù)胶罄m(xù)電路進(jìn)行處理，避免微弱信號被噪聲覆蓋；(2)引入頻率補(bǔ)償電路，消除寄生電容和輸入電容對信號帶寬產(chǎn)生的影響，提高儀器的時間分辨和電流分辨能力；(3)采用電池對前置放大器單獨(dú)供電，設(shè)計電壓調(diào)理電路，降低電源噪音和電壓波動產(chǎn)生的干擾，使儀器可在普通實驗室使用；(4)設(shè)計基于現(xiàn)場可編程邏輯門陣列(Field programmable gate array,FPGA)的高速數(shù)據(jù)采集電路，利用軟件改變芯片內(nèi)部邏輯門的連接方式和邏輯運(yùn)算方法，達(dá)到實現(xiàn)定制信號處理的功能，實現(xiàn)高速同步的數(shù)據(jù)采集；(5)整體儀器采用高度集成化設(shè)計，使其整體尺寸小于12 cm，以實現(xiàn)測量屏蔽系統(tǒng)及儀器的便攜化。

為了驗證Cube系列納米孔道儀器的穩(wěn)定性和靈敏性，本文選擇氣單胞菌溶素(Aerolysin)生物納米孔道作為測量所用納米孔道。相比于較常用的α-HL[31]、恥垢分枝桿菌蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin A,MspA)孔道[32]，Aerolysin具有孔徑窄，且孔道內(nèi)含大量帶電氨基酸等優(yōu)勢，使其在生物分子分析中具有極高的靈敏性、空間分辨率以及構(gòu)型穩(wěn)定性，從而被廣泛地應(yīng)用于小分子核酸、多肽的檢測分析[33]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氯化鉀(≥99.5%)、正癸烷(無水，≥99%)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)均購于美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸(36.0%～38.0%)、乙二胺四乙酸(99.995%)、磷酸鈉(≥98%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，≥99.9%)均購于上海阿拉丁試劑公司；1,2-二植烷?；字?200 mg)購于美國Avanti Polar Lipid Inc.公司，儲存條件為-20 ℃；野生型Aerolysin用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)配置成質(zhì)量濃度為10 μg/mL蛋白溶液，存于-20 ℃冰箱備用；實驗所用待測Poly(dA)4的序列為5’-AAAA-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并通過高效液相色譜提純，儲存條件為-20 ℃；實驗用水均為由Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)制備得到電阻 率為18 MΩ·cm(25 ℃)的超純水。

Bilayer perfusion chamber(BCH-P)檢測池(美國Warner Instruments公司)，由cis和trans兩腔室組成，兩個腔室的容積均為1 mL，其中trans腔室中央弧形區(qū)域中有1個直徑為50 μm的孔用于構(gòu)建磷脂雙分子層以及蛋白納米孔道；實驗所采用的Ag/AgCl電極通過電鍍法制得，銀絲直徑為1.0 mm，購于英國Alfa Aesar公司；ClampFit 10.3數(shù)據(jù)處理軟件(美國Molecular Devices公司)；Nanopore Analysis數(shù)據(jù)處理軟件(實驗室自主開發(fā)，下載網(wǎng)址為https://hysz.nju.edu.cn/ytlong/65/2a/c36917a484650/page.htm)；Origin 9.0(美國OriginLab Corporation 公司)；Cube系列超低電流納米孔道分析儀(Cube-01，實驗室自主開發(fā))；高阻值電阻(1 GΩ)；膜片鉗儀器系統(tǒng)(美國Molecular Devices公司)，包含電流放大器Axonpatch 200B和數(shù)模轉(zhuǎn)換器Digidata 1440A。

1.2 實驗方法

1.2.1 1 GΩ電阻測量Cube納米孔道儀器分為信號處理主機(jī)和前置電流放大器兩部分(圖1A)，其尺寸分別為12 cm×12 cm×8 cm及7.5 cm×5.5 cm×12.6 cm。其中前置電流放大器設(shè)計有電池槽、前置探頭、電極連接件、納米通道檢測池及屏蔽箱，高集成化屏蔽箱的存在可極大的消除外部電磁噪音干擾。

將電池放入電池槽，將1 GΩ電阻用鱷魚夾與兩電極相連后，通過連接線將探頭與電池槽相連，用USB數(shù)據(jù)線將主機(jī)與電腦相連，主機(jī)指示燈亮，用音頻線將主機(jī)與探頭相連(圖1A)，打開探頭開關(guān)，探頭指示燈亮。

圖1 Cube納米孔道儀器(A)及軟件運(yùn)行界面截圖(B)Fig.1 Cube ultrasensitive nanopore instrument (A) and software operation interface screenshot(B)

啟動實驗室設(shè)計的Smart Nanopore軟件，圖1B為軟件界面截圖，具體操作步驟如下：(1)從左向右依次點(diǎn)兩個連接開關(guān)(圖1B-①)，符號由灰變綠則表示連接成功，否則需要檢查連接問題；(2)連接成功后根據(jù)所連的儀器標(biāo)識參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣設(shè)置(圖1B-②)；(3)設(shè)置結(jié)束后點(diǎn)擊Start按鈕，軟件開始運(yùn)行,圖1B-⑥電流顯示界面、1B-⑧電壓顯示界面分別出現(xiàn)相應(yīng)的電流、電壓曲線；(4)通過圖1B-③處進(jìn)行電壓施加設(shè)置，分別通過圖1B中的⑤、⑦、⑨調(diào)節(jié)電流顯示、電壓顯示、時間尺度；(5)點(diǎn)擊圖1B-④處“Conf.”按鈕設(shè)置數(shù)據(jù)存儲路徑以及文件名，點(diǎn)擊“Rec.”按鈕開始或停止記錄。

以上步驟均完成后，開始記錄1 GΩ電阻的測量信息。在5 kHz濾波下，施加電壓由0 mV變至200 mV，再由0 mV變至-200 mV，每次變化值Δ=10 mV，時間間隔5 s，記錄電流隨電壓的變化曲線。一般為了表征納米孔道的電化學(xué)性質(zhì)，可繪制其不同電壓下的電流響應(yīng)曲線，即I～V曲線[32]。因此，這里對1 GΩ電阻用相同的方法表征，同時記錄下電流噪音均方根(RMS)值，并計算一個周期內(nèi)電流噪音信號最高值和最低值之間的差值，即電流噪音峰-峰(Peak-Peak)值。分別將濾波變?yōu)?0、100 kHz，重復(fù)以上步驟。

1.2.2 納米孔道實驗組裝cis和trans腔室成檢測池，在兩端分別注入1 mL Tris-KCl溶液，并置入Ag/AgCl電極，打開開關(guān)，施加電壓調(diào)至100 mV。將磷脂溶液均勻涂抹在檢測池的微孔處，形成磷脂雙分子層，根據(jù)擊破電壓調(diào)節(jié)至合適的膜厚。在200 mV電壓下，在cis端近微孔處小心快速注入0.5～2.0 μL的Aerolysin蛋白溶液，待自組裝形成單個納米孔道后，記錄5、10、100 kHz 3個濾波下的I～V曲線、RMS值。在10 kHz濾波、20 mV電壓下，在cis端緩慢注入20 μL Poly(dA)4溶液，使其終濃度為2 μmol/L，分別記錄100、120、140、160、180 mV下的納米孔道單分子阻斷電流變化。

以上實驗均在溫度(22.0±0.5) ℃，濕度45%±5%條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器穩(wěn)定性測試

納米孔道單分子電化學(xué)測量儀器的穩(wěn)定性評估主要考慮環(huán)境噪音干擾，例如不同時刻外界震動、溫度、濕度、電磁場等變化造成的納米孔道實驗噪音干擾等。為了驗證納米孔道儀器的穩(wěn)定性，本研究首先通過在Cube納米孔道儀器的電極端接入1 GΩ電阻進(jìn)行噪音評估，即測量并比較不同時間內(nèi)、不同截止頻率下儀器的RMS及Peak-Peak水平。

電壓通過雙電極體系施加在電阻兩側(cè)，其中一側(cè)為工作電極，另一側(cè)接地，工作電極通過放大器系統(tǒng)改變施加電壓；同時，電流通過工作電極接入放大器系統(tǒng)，并經(jīng)過前置放大、信號調(diào)理和模數(shù)轉(zhuǎn)換采集到計算機(jī)(圖2A)。納米孔道儀器的貝塞爾低通濾波電路可對輸入信號進(jìn)行降噪處理，如圖2B所示，在施加電壓為0 mV的條件下，改變儀器的截止頻率，隨著截止頻率的增加(5、10、100 kHz)，Peak-Peak值、RMS值也隨之增加，與文獻(xiàn)報道相一致[25]。

圖2 使用電阻驗證Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性。儀器系統(tǒng)設(shè)計方案(A)；在不同截止頻率、0 mV電壓下， 電阻的基線電流(B)、Peak-Peak值(C)、RMS值(D)；以5 kHz截止頻率為例，5天穩(wěn)定性測試的I～V 曲線(E)；不同截止頻率下，5天內(nèi)測得的電阻的電導(dǎo)(F)Fig.2 Stability test of the Cube ultrasensitive nanopore instrument verified using a resistor.Instrument system design(A); Baseline current(B),Peak-Peak value(C),RMS value(D) of the resistor at different cut-off frequencies under the potential of 0 mV;I-V curve(5-days stability test,taking 5 kHz as an example)(E);Conductance values of the resistance at different cut-off frequencies in 5 days(F)

連續(xù)5天進(jìn)行重復(fù)實驗，獲得在5、10、100 kHz 3種截止頻率下(施加電壓為0 mV)的Peak-Peak值分別為(1.70±0.12)、(2.14±0.17)、(69.20±20.08) pA；電流基線的RMS值分別為0.2±0.0、0.3±0.0、9.4±2.3(圖2C-D)。在商品化儀器中進(jìn)行相同重復(fù)實驗，Peak-Peak值分別為(3.87±0.12)、(7.83±0.29)、(90.00±5.00) pA；RMS值分別為(1.0±0.2)、(2.4±0.5)、(18.1±3.3) pA。對比發(fā)現(xiàn)，在5、10、100 kHz條件下，Cube納米孔道儀器獲取的電流基線的RMS值分別比商品化儀器減少了80.0%、87.5%、48.2%，RMS值測量誤差波動也遠(yuǎn)小于該商品化儀器，這說明Cube納米孔道儀器的控制噪音能力更強(qiáng)，測量穩(wěn)定性更好。為了進(jìn)一步說明Cube納米孔道儀器在不同電壓下的穩(wěn)定性，在5 kHz濾波下，獲取連續(xù)5天的I～V曲線(如圖2E)，并分別在5、10、100 kHz 3種截止頻率條件下進(jìn)行5天穩(wěn)定性測試(如圖2F)，計算得到電導(dǎo)分別為(1.00±0.0 1)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，測量誤差均小于1.0%，結(jié)果表明儀器運(yùn)行穩(wěn)定，不隨環(huán)境時間和施加電壓的變化而產(chǎn)生強(qiáng)烈的電流測量波動。

2.2 Aerolysin納米孔道檢測Poly(dA)4

以檢測Poly(dA)4為例，驗證了Cube納米孔道儀器在納米孔道檢測過程中的運(yùn)行情況(如圖3A所示)。圖3B表示在0 mV施加電壓下5、10、100 kHz濾波的電流基線，并計算得到Peak-Peak值分別為(2.88±0.11)、(4.01±0.62)、(300.90±63.20) pA；RMS值分別為(0.4±0.1)、(0.5±0.1)、(30.0±4.6) pA。為進(jìn)一步說明Cube納米孔道儀器在納米孔道檢測過程中的穩(wěn)定性，分別在5、10、100 kHz 3種截止頻率下進(jìn)行5天納米孔道的穩(wěn)定性測試，其中在5 kHz濾波下得到I～V曲線如圖3C，分別計算得到電導(dǎo)為(0.53±0.01)、(0.53±0.01)、(0.53±0.01) nS(如圖3D)，測量誤差均小于2.4%，結(jié)果表明儀器測量基本穩(wěn)定。選取3天不同的施加電壓值(0～180 mV，ΔV=10 mV)，計算施加電壓值的實際值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，由不同的實際電壓的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算得到儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.014 mV，占施加電壓變化量(10 mV)的0.14%，表明該儀器的誤差較小，可用于超靈敏的電化學(xué)測量實驗。

圖3 Aerolysin納米孔道檢測Poly(dA)4的示意圖(A);不同截止頻率下，單個Aerolysin納米孔道的 電流基線(B);5 kHz下，Aerolysin納米孔道5天穩(wěn)定性測試的I～V曲線(C)； 5天穩(wěn)定性測試的不同頻率下Aerolysin納米孔道的電導(dǎo)(D)Fig.3 Schematic diagram of poly(dA)4 detection by an Aerolysin nanopore(A);Current baseline of a single Aerolysin nanopore at different cut-off frequencies(B);I-V curve of an Aerolysin nanopore

Aerolysin納米孔檢測Poly(dA)4得到的原始數(shù)據(jù)為時間電流曲線(圖4A)，定義未通過待測物時刻的電流值為納米孔道開孔電流I0，當(dāng)有待測物通過孔道時的殘余電流值為I，持續(xù)時間為阻斷時間(Duration time)，待測物過孔的殘余電流程度為I/I0。統(tǒng)計分析過孔信號的時間和電流可以得到不同電壓下待測物過孔的阻斷時間、殘余電流程度等信息，并繪制了阻斷時間統(tǒng)計直方圖、殘余電流程度統(tǒng)計直方圖(圖4B、C)。統(tǒng)計不同電壓(100、120、140、160、180 mV)下的阻斷信息，阻斷時間分別為(7.33±0.15)、(4.85±0.28)、(3.53±0.05)、(2.53±0.04)、(2.23±0.04) ms；殘余電流程度分別為0.48±0.00、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.00、0.57±0.01。圖4D為利用商品化儀器獲取不同施加電壓下的阻斷信號，并選取與Cube儀器得到的相同個數(shù)的信號，繪制殘余電流程度統(tǒng)計直方圖，其殘余電流程度分別為0.47±0.01、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.01、0.57±0.01。分別對比Cube納米孔道儀器和商品化儀器在不同施加電壓下獲取信號的殘余電流程度，兩者數(shù)值誤差均不超過0.01，說明Cube納米孔道儀器可應(yīng)用于納米孔道分析實驗。

圖4 Poly(dA)4通過Aerolysin納米孔道的原始電流軌跡圖(A)；不同電壓下，Poly(dA)4的阻斷時間(B)和殘余 電流程度(C)統(tǒng)計直方圖；商品化儀器得到的Poly(dA)4在不同電壓下的殘余電流程度統(tǒng)計直方圖(D)Fig.4 Original current traces of Poly(dA)4 traversing across an aerolysin nanopore(A);Statistical histograms of duration times(B) and residual current blockages(C) at different voltages;Statistical histograms of residual current blockages at different voltages obtained by commercial instrument(D)

進(jìn)一步分析Cube納米孔道儀器在100 mV下獲取的Poly(dA)4穿過Aerolysin納米孔道信號，其殘余電流程度為0.48±0.01。文獻(xiàn)使用商品化儀器在相同條件下所得的殘余電流程度為0.48±0.01[25]，兩者殘余電流程度一致，結(jié)果高度吻合。進(jìn)一步表明基于Cube納米孔道儀器的生物納米孔實驗具備高度可重復(fù)性，數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

如圖5所示，采用Cube納米孔道儀器在1周的不同3天進(jìn)行穩(wěn)定性納米孔實驗。對獲取信號的殘余電流程度和阻斷時間進(jìn)行統(tǒng)計分析并擬合，得到不同時間測得同一施加電壓下的殘余電流程度，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.004，占?xì)堄嚯娏鞒潭鹊陌俜直龋磳堄嚯娏鞒潭葴y量影響小于0.6%。本實驗中，Poly(dA)4信號的阻斷時間隨電壓升高而減小，因此其在180 mV電壓下具有最小的阻斷時間。通過比較在180 mV電壓下阻斷時間標(biāo)準(zhǔn)偏差占相應(yīng)阻斷時間的百分比，顯示其最大值僅為2.8%，說明Cube納米孔道儀器檢測誤差對瞬時納米孔信號的失真度影響小，具有高準(zhǔn)確性。

圖5 以Aerolysin測量Poly(dA)4為例時，Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性測試;不同電壓下Poly(dA)4殘余電流阻斷 程度(A)和阻斷時間(B)的統(tǒng)計平均值Fig.5 Instrument stability test of Cube nanopore instrument for aerolysin detection of Poly(dA)4;Averaged statistical residual current blockages(A) and duration times(B) of Poly(dA)4 under different voltages

3 結(jié) 論

本研究主要考察了Cube納米孔道儀器的穩(wěn)定性及其在納米孔道檢測中的應(yīng)用。在截止頻率為5、10、100 kHz條件下，電流基線的噪音均方根(RMS)值分別比商品化儀器減小了80.0%、87.5%、48.2%，說明Cube納米孔道儀器的抑制噪音能力更強(qiáng)，儀器測量穩(wěn)定性更好。在連續(xù)穩(wěn)定性測試中，Cube由I～V曲線得到在5、10、100 kHz截止頻率下電阻的電導(dǎo)為(1.00±0.01)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，測量誤差均小于1.0%，而商品化儀器得到電導(dǎo)為(0.94±0.01) nS，說明Cube納米孔道儀器滿足納米孔道實驗對儀器的穩(wěn)定性要求。在納米孔道檢測的應(yīng)用中，通過Aerolysin納米孔道檢測Poly(dA)4的實驗對比了Cube儀器和商品化儀器在不同施加電壓下獲取的單分子信號殘余電流程度，兩者誤差均小于0.01；100 mV時待測物Poly(dA)4過Aerolysin納米孔的信號經(jīng)統(tǒng)計得到的殘余電流程度為0.48±0.01，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[25]，說明檢測結(jié)果具有較高的可重復(fù)性。Cube納米孔道儀器憑借其高帶寬、噪音低、體積小的優(yōu)勢以及其特殊的分體式結(jié)構(gòu)設(shè)計，保證了其電流檢測的穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)在實驗室環(huán)境外的便攜式現(xiàn)場快速納米孔道檢測，以期可應(yīng)用于臨床即時檢驗等。