李麗麗，李 月，盧 恒，王 曉

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250014)

金銀花是忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，是藥食同源的大宗中藥材。其藥用歷史悠久，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒和溫病發(fā)熱等癥，效果顯著。體內(nèi)外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金銀花提取物具有顯著的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[1-2]。

代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系受外界刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化來(lái)研究生命體系的一門科學(xué)[3-4]，與強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)效應(yīng)的中醫(yī)藥具有天然的趨同性[5-6]。代謝物作為生物學(xué)事件物質(zhì)基礎(chǔ)的終端，其變化與生物表型最為接近，更能直接準(zhǔn)確地反映生理狀態(tài)[7-8]。植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)重要分支[9]。植物中具有豐富的初生代謝物和次生代謝物[10-11]。次生代謝與初生代謝密切相關(guān)，初生代謝為次生代謝提供原料和能量。金銀花具有豐富的化學(xué)成分，已從金銀花中分離得到140多種成分[1]。然而已報(bào)道的金銀花研究往往是靶向性研究，僅關(guān)注有限化合物，如酚酸類成分、黃酮類成分[12-13]、色素類成分[14]、環(huán)烯醚萜苷類成分[15]。金銀花非靶向代謝組學(xué)(初生代謝和次生代謝)的研究鮮有報(bào)道。

已有研究指出不同采收期金銀花的質(zhì)量不同，其綠原酸和木犀草苷的含量有顯著差異[16]。金銀花的藥效成分與其初生和次生代謝密切相關(guān)，通過(guò)金銀花的代謝組學(xué)研究，探究不同花期成分的變化規(guī)律，可為金銀花藥效成分代謝調(diào)控機(jī)制的深入研究及質(zhì)量提升提供理論指導(dǎo)。液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)是目前植物代謝組學(xué)分析中應(yīng)用最為廣泛的分析方法[17-19]。本研究擬通過(guò)優(yōu)化金銀花的提取方法，建立基于LC-MS的金銀花代謝組學(xué)分析方法，對(duì)金銀花中的初生和次生代謝物進(jìn)行定性分析,并應(yīng)用于不同花期金銀花的樣品分析，以探究不同花期的代謝差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(ACQUITY,H-Class,美國(guó)沃特世公司 )，飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF MS,Impact Ⅱ,德國(guó)布魯克公司)。乙腈、甲醇(色譜級(jí)，德國(guó)默克公司);甲酸(色譜級(jí)，德國(guó)Honeywell Fluka)。標(biāo)準(zhǔn)品：綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草苷、蕓香苷、色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酸(FA18∶0)(純度≥98%)，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。超純水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超純水系統(tǒng)(美國(guó))制備。

1.2 樣品信息

金銀花采自山東省臨沂市平邑縣實(shí)驗(yàn)基地。植株經(jīng)王曉教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.，品種為大毛花。2018年5月，分別采摘三青期(5-17)、二白期(5-18)、大白期(5-19)、銀花期(5-21)和金花期(5-22)的金銀花樣品。每個(gè)花期的樣品平行6份，采摘后立即放入液氮中保存。等量稱取不同花期的金銀花樣品，混合均勻，制備質(zhì)量控制樣品(QC)。

1.3 樣品制備

將不同花期的金銀花在液氮下研磨成粉末。準(zhǔn)確稱取300 mg樣品于2 mL eppendorf 管中，加入1.5 mL 提取試劑，渦旋5 min，離心10 min，取上清液。

1.4 LC-MS分析條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司)，流速為0.3 mL/min，柱溫為45 ℃，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈。洗脫梯度：起始梯度為5% B；10 min，線性升至25% B；15 min，線性升至95% B，維持5 min；最后降至5%B，維持5 min?？倳r(shí)間為25 min。

質(zhì)譜使用電噴霧離子源。離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓，正離子模式下3 500 V，負(fù)離子模式下3 000 V；干燥氣流速為8 L/min；霧化氣壓力為200 kPa；干燥氣溫度為200 ℃。四極桿離子能量為3 eV。碰撞池參數(shù)：碰撞能為7 eV，傳輸時(shí)間為60 μs，碰撞池射頻電壓振幅為750 Vpp，脈沖前等待時(shí)間為5 μs。質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z50～1 500。二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)碰撞能為10～50 eV。

1.5 數(shù)據(jù)處理

由LC-MS分析得到的原始數(shù)據(jù)使用MSDIAL軟件[20]獲得峰值表(質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、峰面積)。主成分分析(PCA)由SIMCA軟件(瑞典)完成。非參數(shù)檢驗(yàn)由SPSS軟件(美國(guó))完成。聚類分析由MEV軟件(美國(guó))[21]完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 金銀花代謝組學(xué)分析方法的建立

使用不同體積比的甲醇-水溶液(7∶13、9∶11、11∶9、13∶7、3∶1、17∶3和19∶1)對(duì)金銀花進(jìn)行提取，每個(gè)提取條件平行6份樣品。分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式下的LC-MS分析，以峰面積(S/N>3)和峰個(gè)數(shù)評(píng)價(jià)提取效率。如圖1所示，隨著甲醇比例的提高，峰個(gè)數(shù)和峰面積均顯著增加。正離子模式下，甲醇與水的體積比為3∶1時(shí)峰面積和峰個(gè)數(shù)達(dá)到最大；負(fù)離子模式下，峰個(gè)數(shù)在甲醇與水的體積比為3∶1時(shí)達(dá)到最大，而峰面積在體積比為17∶3時(shí)達(dá)到最大，但峰個(gè)數(shù)有所下降。考慮到金銀花中含有豐富的親水性糖苷類成分，選擇提取試劑為甲醇-水(3∶1)。

2.2 方法學(xué)考察

平行處理6份QC樣品，用甲醇-水(3∶1)提取后進(jìn)行LC-MS分析，每間隔4 h分析1個(gè)樣品，以考察分析方法的重復(fù)性和精密度。計(jì)算每個(gè)峰在6個(gè)樣品中峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，并統(tǒng)計(jì)不同RSD范圍(0～10%、10%～20%、20%～30%、>30%)內(nèi)的峰個(gè)數(shù)，以及相應(yīng)的峰面積之和；計(jì)算不同RSD范圍內(nèi)的峰個(gè)數(shù)占比，以及累計(jì)峰面積占比。結(jié)果顯示，在正離子模式下，95.7%的峰的RSD在30%以內(nèi)，峰面積占比為97.0%；在負(fù)離子模式下，97.5%的峰的RSD在30%以內(nèi)，峰面積占比為96.8%。結(jié)果說(shuō)明方法的重復(fù)性和精密度良好，滿足代謝組學(xué)分析的要求。金銀花的LC-MS總離子流圖見(jiàn)圖2。

2.3 金銀花代謝物定性分析

根據(jù)質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)金銀花中的初生代謝物和次生代謝物進(jìn)行定性分析。將二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)有標(biāo)樣的化合物使用標(biāo)樣驗(yàn)證。應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫(kù)包括Metlin(metlin.scripps.edu)、MassBank(massbank.jp)、Bruker MetaboBASE Personal library等。在金銀花中定性出氨基酸(8個(gè))、核苷(11個(gè))、脂肪酸(34個(gè))、脂質(zhì)(25個(gè))等初生代謝物以及酚酸(16個(gè))、黃酮(30個(gè))、環(huán)烯醚萜苷(10個(gè))次生代謝物共157個(gè)代謝物(見(jiàn)表1)。其中次生代謝物的二級(jí)質(zhì)譜有其特定的裂解規(guī)律。

單咖啡酰奎寧酸(綠原酸、新綠原酸)和二咖啡?？鼘幩?異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C)是金銀花中主要的酚酸類代謝物。二級(jí)質(zhì)譜分析有明顯的咖啡酸裂解特征：子離子m/z163、145、135和117。二咖啡酰奎寧酸還會(huì)出現(xiàn)丟失1個(gè)咖啡?；淖与x子(m/z337，[M+H-Caffeoyl-H2O]+)。在金銀花中還定性出香豆酸衍生物、香豆素衍生物、阿魏酸、奎寧酸等酚酸代謝物。

金銀花中的黃酮類成分大多以糖苷形式存在。黃酮苷元大多與1個(gè)糖或2個(gè)糖結(jié)合。糖苷配體主要是己糖、脫氧己糖和五碳糖，二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)會(huì)出現(xiàn)中性丟失糖苷配體的裂解特征，分別對(duì)應(yīng)中性丟失m/z162、146和132。如木犀草苷由木犀草素和葡萄糖組成，在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)特征子離子為[M+H-162]+。蕓香苷是含有2個(gè)糖的糖苷，糖基配體由1個(gè)脫氧己糖和1個(gè)己糖組成，在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)特征子離子為[M+H-146]+和[M+H-146-162]+。在金銀花中鑒定出芹菜素、槲皮素、木犀草素、柚皮素、異鼠李素、山奈酚等苷元。

環(huán)烯醚萜苷在一級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)大多會(huì)出現(xiàn)[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+和[2M+Na]+信號(hào)。如斷馬錢子酸出現(xiàn)m/z375、397、749和771信號(hào)。環(huán)烯醚萜苷在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)具有豐富的子離子，會(huì)出現(xiàn)中性丟失162(糖苷)、18(H2O)、26(C2H2)、28(CO)、44(CO2)的特征子離子[22-23]。如斷馬錢子酸在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)的子離子主要是 213[M+H-162]+、195[M+H-162-18]+、177[M+H-162-18-18]+、151[M+H-162-18-18-26]+、125[M+H-162-18-18-26-26]+、107[M+H-162-18-18-26-26-18]+。金銀花中定性出馬錢苷酸、 獐牙菜苷、馬錢子苷等環(huán)烯醚萜苷類代謝物。

表1 金銀花中定性的代謝物Table 1 The identified metabolites in Lonicera japonica

(續(xù)表1)

2.4 不同花期金銀花代謝組學(xué)分析

三青期(S1)、二白期(S2)、大白期(S3)、銀花期(S4)、金花期(S5)金銀花樣品的主成分分析(PCA)得分圖如圖3所示，可以看出不同花期的金銀花在主成分1(PC1)有明顯分離。在正離子模式數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析時(shí)，PC1為0.451;在負(fù)離子模式數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析時(shí)，PC1為0.482。

對(duì)不同花期金銀花樣品中已定性代謝物做非參數(shù)檢驗(yàn)，得到p值，并計(jì)算兩組之間的比值。篩選p<0.05和比值>1.5的代謝物為有顯著性差異的代謝物。結(jié)果顯示，在金銀花的生長(zhǎng)過(guò)程中，氨基酸代謝、核苷代謝、脂肪酸代謝、脂質(zhì)代謝、多酚代謝等發(fā)生了明顯變化。

將差異代謝物繪制熱圖。圖4為次生代謝物的熱圖，由圖可見(jiàn)酚酸類、黃酮類和環(huán)烯醚萜苷類代謝物的含量隨著花期的增加而總體呈下調(diào)趨勢(shì)。酚酸類代謝物在S2和S3有顯著性差異，在大白期其含量明顯下降。大部分黃酮類代謝物在S2和S3有顯著性差異，在大白期含量明顯下降。其中，芹菜素及其糖苷類代謝物在S4和S5出現(xiàn)顯著上調(diào)，在開(kāi)花期含量增加。環(huán)烯醚萜苷類代謝物在S3和S4有顯著性差異，受開(kāi)花的影響較大。

圖4 差異次生代謝物的熱圖分析Fig.4 Heat map of differential secondary metabolites A：phenolic acids(酚酸類)，B：flavonoids(黃酮類)，C：iridoids (環(huán)烯醚萜苷類)； red represent higher content and green represent lower content

圖5 差異初生代謝物的熱圖分析Fig.5 Heat map of differential primary metabolites A：amino acids(氨基酸類)，B：nucleosides(核苷類)，C：lipids(脂質(zhì)),D：fatty acids(脂肪酸類)； red represent higher content and green represent lower content

初生代謝物的熱圖如圖5所示。由圖可見(jiàn)氨基酸類代謝物在S4和S5有顯著性差異，在金花期的含量明顯下降。核苷類代謝物在S4期開(kāi)始下降。脂質(zhì)中大部分溶血磷脂酰膽堿(Lyso PC) 和溶血磷脂酰乙醇胺(Lyso PE)的含量隨著花期的增加而上調(diào)，在銀花期和金花期顯著增加。磷脂酰膽堿(PC)隨著生長(zhǎng)發(fā)育期其含量顯著下調(diào)。大部分脂肪酸(FA)隨著生長(zhǎng)發(fā)育期其含量上調(diào)，而氧化脂肪酸(OxFA)的含量下降。

3 結(jié) 論

本研究建立了基于LC-MS的金銀花代謝組學(xué)分析方法，并對(duì)金銀花中的初生代謝物和次生代謝物進(jìn)行了定性分析。該方法具有良好的重復(fù)性和精密度。將該方法應(yīng)用于不同花期的金銀花代謝組學(xué)分析，揭示了初生代謝物和次生代謝物在不同花期的代謝規(guī)律，為金銀花的種植和采收提供了科學(xué)依據(jù)。