林宸詩，陳玉紅，尹莉芳

（中國藥科大學藥學院藥劑學教研室，南京210009）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，疾病特征是動脈壁上的脂肪條紋逐漸發(fā)展成動脈粥樣硬化和特征性斑塊，這些動脈粥樣斑塊的急性破裂會形成局部血栓，導致病灶動脈的部分或全部閉塞，主要臨床表現(xiàn)包括缺血性心臟病、缺血性腦卒中和周圍動脈疾病。動脈粥樣硬化及其伴隨的臨床并發(fā)癥如腦卒中和缺血性心臟病，是全球死亡事件的主要原因，2016 年約有1 790 萬人（占全球死亡總數(shù)的31%）死于此類心血管疾病。2013 年，中國缺血性心臟病和腦卒中的住院總費用為705億元，給國家和患者帶來巨大的經濟負擔。

臨床數(shù)據(jù)表明，動脈粥樣硬化與免疫介導的炎癥有關，特異性及非特異性免疫細胞，例如巨噬細胞、T 淋巴細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、肥大細胞、B淋巴細胞等，在動脈粥樣硬化斑塊中普遍存在［3］。諸如病原體、免疫球蛋白、細胞因子和趨化因子之類的炎癥介質在動脈粥樣硬化斑塊中分布不均。在小鼠主動脈中易發(fā)生動脈粥樣硬化的部位（比如血管外膜），抗原呈遞細胞的數(shù)量比正常部位多，這些證據(jù)均表明動脈粥樣硬化的部位存在炎癥反應［4］。

1 非特異性免疫和動脈粥樣硬化

生物體對病原微生物和病原體的非特異性即時反應稱為非特異性免疫。非特異性免疫系統(tǒng)細胞（DCs和巨噬細胞）作為第一響應者，檢測內環(huán)境中的疾病相關分子，即氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein，oxLDL）的表達。非特異性免疫細胞接觸這些疾病相關分子，并與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）相互作用。TLR 識別疾病相關分子，引起急性炎癥基因的激活和急性非特異性免疫炎癥介質的釋放。敲除非特異性免疫信號通路基因的小鼠無論血液中膽固醇水平高低，都呈現(xiàn)動脈粥樣硬化癥狀減輕現(xiàn)象，表明非特異性免疫在動脈粥樣硬化中起作用［5］。

巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）基因對巨噬細胞增殖起促進作用。高脂血癥小鼠的M-CSF 基因被敲除，顯示動脈粥樣硬化減少的現(xiàn)象［6］。各種巨噬細胞在非特異性免疫中發(fā)揮作用。在小鼠中發(fā)現(xiàn)了兩種亞型的巨噬細胞：一種具有高表達的Ly6C，具有促進炎癥的作用［7］，是促炎M1 巨噬細胞的前體。另一種亞型是M2 巨噬細胞，與動脈粥樣硬化斑塊的分類有關［8］。

自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）是促進動脈粥樣硬化的非特異性免疫細胞。用Ly49A 轉基因小鼠的骨髓細胞移植的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體缺陷型（LDLR-/-）小鼠，缺乏功能性NK 細胞，與從非轉基因供體接受骨髓細胞的LDLR-/-小鼠相比，主動脈根部有小范圍動脈粥樣硬化斑塊生成［9］。有研究報道NK細胞的致動脈粥樣硬化功能依賴于如穿孔素和顆粒酶B等介質［10］。

肥大細胞也會影響動脈粥樣硬化進程。在缺乏肥大細胞的高脂血癥小鼠中，炎癥減少，病變進程減慢。有研究報道了肥大細胞缺陷小鼠的膽固醇水平較低，這表明先天性肥大細胞信號傳導與膽固醇體內平衡之間存在聯(lián)系［11］。

DCs是特異性和非特異性免疫系統(tǒng)的橋梁，是免疫細胞活化過程中的上游成分，DCs獨特的地位使它成為疫苗研發(fā)重要的靶點。高脂血癥中，內膜上的DCs迅速攝取脂質，而注射CD11c特異性白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor，DTR）的轉基因小鼠DCs 缺失，引起LDLR-/-小鼠的早期病變減慢，證明了DCs 的促動脈粥樣硬化作用［12］。血漿樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）存在于鼠和人類的動脈粥樣硬化斑塊中，pDCs 對oxLDL 的反應激活抗原特異性T 細胞，注射抗小鼠pDCs 抗原-1 抗體的ApoE-/-小鼠缺少pDCs，減緩主動脈竇動脈粥樣硬化進程，斑塊炎癥減少，T 細胞的活化被全面抑制［13］，證實了pDCs 通過激活自身抗原誘導免疫反應促進動脈粥樣硬化［14］。

2 特異性免疫和動脈粥樣硬化

與非特異性免疫系統(tǒng)的遲緩、非特異性相比，特異性免疫反應目標更為明確。免疫母細胞的發(fā)育產生識別特定抗原的多種T細胞和B細胞。

非特異性免疫細胞例如DCs 和巨噬細胞，呈遞經T細胞識別的抗原，形成了主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）。呈遞抗原后，激活T細胞并增殖。CD8+T細胞大量增殖，產生細胞因子，對抗原具有特異性細胞毒性。CD4+T 細胞激活也產生細胞因子促進隨后的B 細胞激活并產生特異性免疫球蛋白。

研究表明B 細胞能延緩高膽固醇血小鼠動脈粥樣硬化進程［15］。B1 細胞產生的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M 同 型 的 天 然 抗 體 可 與oxLDL 的極性基團反應，可促進B 細胞的抗動脈粥樣硬化作用［16］。大量實驗數(shù)據(jù)表明，B細胞在動脈粥樣硬化中的作用受細胞亞型的影響，B1 細胞具有抗動脈粥樣硬化作用，B2 細胞具有促動脈粥樣硬化作用［17-18］。

動脈粥樣硬化斑塊含有DCs、充當抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）作用的巨噬細胞和T 細胞。APC-T 細胞相互作用表明了可通過斑塊中的突觸激活特異性免疫（圖1）。在共刺激分子如CD40，CD80 等作用下，DCs 可向T 細胞呈遞動脈粥樣硬化抗原（如oxLDL 和HSP-60），引起T細胞分化和增殖，并分泌細胞因子［19］。將CD4+T細胞移植到免疫缺陷型高脂血癥小鼠體內，觀察到動脈粥樣硬化的加重［20］。CD4+T 細胞的促動脈粥樣硬化作用部分是由于Th1細胞因子反應，特別是干擾素-γ（IFN-γ）的強烈的促炎作用。移植CD4+T 細胞，對LDL 的反應導致動脈粥樣硬化加劇，說明LDL 是CD4+T 細胞應答的抗原［21］。另有研究表明Th2 細胞因子反應（如IL-10）可以防止動脈粥樣硬化［20］。除了CD4+細胞外，其他免疫細胞，如巨噬細胞、肥大細胞和NK細胞也可分泌Th2細胞因子抑制動脈粥樣硬化［22］。

圖1 APC和T細胞間的作用

CD4+T 細胞是動脈粥樣硬化研究領域熱點之一，它的另一亞型是CD4+調節(jié)性T 細胞（Treg）。Treg細胞標志物是轉錄因子的表達產物——FoxP3。使用白喉毒素受體轉基因法或通過針對FoxP3 的疫苗使FoxP3+細胞選擇性缺失，加速高膽固醇血小鼠的動脈粥樣硬化進程［23］。因此，CD4+Treg細胞能夠減緩動脈粥樣硬化。

CD8+T 細胞最初不是研究的焦點，是由于基因敲除嚴重降低了CD8+T 細胞的數(shù)量，難以觀察到其對小鼠的動脈粥樣硬化影響［24］。近期研究報道，在高膽固醇小鼠中，CD8+T 細胞先于CD4+活化［25］，CD8+T 細胞促進高膽固醇血小鼠的動脈粥樣硬化進程［26］。CD8+T 細胞達到最高水平三分之一的患者在隨訪期間，冠狀動脈疾病發(fā)生率增加［27］。因此，與CD4+T 細胞相似，CD8+Treg細胞也促進動脈粥樣硬化。

綜上所述，特異性免疫系統(tǒng)和非特異性免疫系統(tǒng)的許多組成部分均參與調節(jié)動脈粥樣硬化，這些組分之間的復雜的相互作用可導致動脈粥樣硬化的惡化或改善（表1）。鑒于特異性免疫系統(tǒng)在動脈粥樣硬化中的主要作用，其疫苗療法為動脈粥樣硬化治療提供新思路。正在研究的幾種用于疫苗接種的候選抗原，LDL 及其蛋白質復合體（ApoB-100）位于前列。

3 動脈粥樣硬化斑塊內相關抗原

抗動脈粥樣硬化的疫苗治療方案是誘導機體產生特異性免疫應答。這種方法的難點在于確定與動脈粥樣硬化形成相關的特異性抗原，使其可用于激活抗原特異性免疫應答。大多數(shù)尋找潛在抗原的研究仍處于臨床前試驗階段（表2）。

3.1 外源性抗原

探索抗原的合理方法是將重點放在病灶本身即動脈粥樣硬化斑塊。在動脈粥樣硬化斑塊中已發(fā)現(xiàn)許多外源抗原，包括肺炎支原體、肺炎衣原體和牙齦卟啉單胞菌等，腸道病毒、人類免疫缺陷病毒、巨細胞病毒和丙型肝炎病毒等病毒。至于這些病原體是否引致動脈粥樣硬化，仍未能確定。

牙周病原體最近在研究中受到重視，許多人發(fā)現(xiàn)牙周病患者多伴隨動脈粥樣硬化疾?。?8］。實驗動物暴露于牙齦卟啉單胞菌后，動脈粥樣硬化加劇，而對牙齦卟啉單胞菌的免疫減緩了動脈粥樣硬化［29］。不過這些病原體在人類動脈粥樣硬化中的直接作用仍然是不確定的，目前尚不清楚靶向牙周病原體的疫苗是否適用于人類動脈粥樣硬化患者。

表2 部分疫苗臨床前研究進展

表1 免疫細胞與動脈粥樣硬化的作用

3.2 內源性抗原：LDL和ApoB-100衍生抗原

因為LDL和其他含有ApoB-100的脂蛋白是動脈粥樣硬化血栓形成的主要原因，所以源自它們的抗原是疫苗開發(fā)的首選。使用不同輔助基團修飾疫苗制劑中的全天然或oxLDL，在實驗動物身上已經證明了其免疫效果。然而，抗原的確切表位和機制尚未完全清楚。

由于LDL 是多種甘油三酯、載脂蛋白、磷脂和膽固醇酯等組成的大分子物質，所以在臨床可用的疫苗制劑中使用天然的LDL 作為抗原是不實際的。LDL 分子的復雜性使得分子內的免疫原性表位難以確定。鑒于使用LDL 作為抗原免疫得到了良好的實驗數(shù)據(jù)，確定LDL 中的抗動脈粥樣硬化抗原表位是重中之重。為此，Antoniak等［30］做了廣泛研究，以確定ApoB-100（LDL 和其他致動脈粥樣化脂蛋白的主要蛋白質組分）中的潛在抗原表位，然后將其作為抗原通過免疫實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化作用。研究最初篩選了由4 536 個氨基酸組成的人體ApoB-100 蛋白，并設計了跨越整個ApoB-100序列的302 個肽庫（每個20 個氨基酸，與前一個序列具有5-氨基酸重疊）。在這些20聚體肽序列中，鑒定了在人血漿中檢測到具有抗體的免疫應答的102 種肽。隨后的測試顯示，當該疫苗制劑用于高脂血癥小鼠時，幾種免疫反應性肽（包括p2、p143、p210）使動脈粥樣硬化現(xiàn)象減少40%～70%［31］。因為基于p210的疫苗具有最持久的抗動脈粥樣硬化作用，有研究團隊已經使用p210 作為疫苗制劑中的原型抗原［32］。由于表位研究使免疫學研究更精準，所以使用ApoB-100肽作為抗原，是開發(fā)動脈粥樣硬化疫苗的臨床前關鍵步驟。

3.2.1 p210疫苗 與對照受試者相比，使用p210疫苗免疫的患者主動脈粥樣硬化顯著減輕［33］。設計實驗研究p210 IgG 滴度的變化，對照組25 周內IgG滴度無明顯變化，但實驗組在25周時表現(xiàn)出高p210 IgG 滴度，且接種p210免疫的小鼠IgG 滴度顯著低于僅接受佐劑的小鼠。這一觀察結果表明：（1）p210 疫苗誘導抗體類轉換為IgG；（2）p210 IgG可以作為疫苗接種的標志物。

除了減少主動脈粥樣硬化之外，p210 疫苗還激活CD8+T 細胞，在免疫位點和動脈粥樣硬化斑塊中引起樹突狀細胞的減少［34］。有實驗報道，將CD8+T 細胞從p210 免疫的小鼠移植到幼小的非免疫小鼠中，驗證了主動免疫的抗動脈粥樣硬化作用［35］。

p210可誘導CD8+T和CD4+T細胞反應。通過p210 免疫抑制動脈粥樣硬化與CD4+CD25+T 細胞反應有關。注射抗CD25 抗體減少CD4+CD25+T細胞，能降低p210免疫的抗動脈粥樣硬化作用［36］。此外，Klingenberg 等［37］用霍亂毒素B 型（cholera toxin B subunit，CTB）融合的p210 組成的重組蛋白對雌性ApoE-/-小鼠鼻腔給藥，每周兩次。對照組小鼠注射與CTB 或PBS 融合的卵清蛋白肽。實驗組的小鼠主動脈竇的動脈粥樣硬化減輕。

由p210引起不同的細胞免疫應答可能是由于以下原因：（1）p210 載體形式，用CTB 重組或游離態(tài)；（2）遞送途徑-皮下給藥與黏膜給藥的差異；（3）p210 的劑量；（4）p210 給藥的持續(xù)時間。然而，無論以何種形式遞送，p210 免疫后動脈粥樣硬化的減輕，表明p210是疫苗制劑的候選抗原。

3.2.2 其他ApoB-100 相關抗原 來自肺炎衣原體和熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）60 的肽和具有ApoB-100 氨基酸殘基688 至707 的肽構成了多抗原組合體，用這種多抗原表位的免疫減少了動脈粥樣硬化，且導致巨噬細胞的減少和斑塊中的CD4+FoxP3 T 細胞的增加［38］。Kimura 等［39］預測了2 個肽片段，ApoB3501-3516和ApoB978-993，用于免疫的ApoE-/-小鼠時可通過IL-10 依賴性機制減少動脈粥樣硬化。

4 動脈粥樣硬化疫苗研究中的其他抗原

使用疫苗調節(jié)動脈粥樣硬化中的免疫應答的方法不僅限于LDL和ApoB-100相關的抗原。動脈粥樣硬化血管疾病的復雜性為其他抗原研究提供了可能性。

4.1 膽固醇酯轉運蛋白疫苗

膽固醇酯轉運蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）是抗體誘導型動脈粥樣硬化疫苗的候選抗原。CETP 是一種酶，可促進膽固醇酯從HDL 轉移到LDL，甘油三酸酯從LDL 轉移到HDL［40］。體內HDL 濃度與心血管疾病風險呈現(xiàn)負相關［41-42］。使用CETP 肽和破傷風毒素肽（含T 細胞表位）一起進行疫苗接種可增加家兔的HDL 膽固醇水平并減緩動脈粥樣硬化進程［54］。但是，CETP 疫苗的Ⅰ期臨床試驗顯示HDL 膽固醇水平與空白組比并無顯著性差異［43］。

4.2 其他脂質抗原

天然IgM 抗體可識別凋亡細胞表面的oxLDL表位和磷酰膽堿（Phosphorylcholine，PC）頭部基團，并阻止巨噬細胞抑制和oxLDL 凋亡細胞的攝取?？筆C 抗體可用于預防肺炎鏈球菌感染。LDLR-/-小鼠對肺炎鏈球菌主動免疫產生了oxLDL 抗體，主要是IgM 同型，并呈現(xiàn)動脈粥樣硬化的減輕［44］。oxLDL 特異性IgM 的增加歸因于PC 對oxLDL 和肺炎鏈球菌誘導的抗體的交叉反應，表明肺炎鏈球菌和oxLDL 之間存在分子模擬特征。一些研究在疫苗的背景下進一步研究和擴展了分子模擬物［45］，該組使用與CpG 寡核苷酸偶聯(lián)的PC-keyhole血藍蛋白偶聯(lián)物作為佐劑并多次對ApoE-/-小鼠腹膜內注射免疫。PC 免疫血清可顯著增加抗PC 和oxLDL 的IgG 和IgM 抗體，減少巨噬細胞oxLDL 的攝取，并減輕動脈粥樣硬化。

4.3 針對HSP抗原的疫苗

HSP是一種高度保守的應激蛋白，它們在正常條件下存在于細胞中，當細胞暴露于壓力條件下（例如pH變化或缺氧）時可以高水平表達。HSP同樣影響動脈粥樣硬化進程［46］。在最近的一項研究中，該疫苗使用了PBS 緩沖液配制的全蛋白HSP65、DNA 或兩者結合進行多次鼻腔用藥，所有疫苗制劑均誘導HSP65 IgG 應答，降低膽固醇水平，減少動脈粥樣硬化［47］。

4.4 樹突細胞疫苗

DCs是最有效的抗原呈遞細胞，通過DCs進入宿主的抗原遞送可引起有效的免疫反應。有研究者以oxLDL 作為抗原，將細胞靜脈注射到新生小鼠中，負載oxLDL 的DCs 的轉移誘導產生Th1 應答，增加oxLDL IgG滴度，減少動脈粥樣硬化［48］。

4.5 流感疫苗與動脈粥樣硬化

有文獻報道通過對心血管疾病的患者接種流感疫苗來預防動脈粥樣硬化等心血管疾?。?9］。調查研究表明，流感季節(jié)期間急性心肌梗死和病死率升高，表明心血管疾病與流行性感冒之間存在關聯(lián)［50］。最近的大數(shù)據(jù)分析進一步提出了流感疫苗有益于心血管疾病二次保護［51］。這些報告支持進一步研究使用流感疫苗以減少動脈粥樣硬化的發(fā)生率，并有助于了解其尚未知曉的作用機制。流感疫苗的接種可能減少了動脈粥樣硬化斑塊中的炎癥信號傳導，進而減少急性心血管疾病。

5 總結與展望

隨著醫(yī)藥科技水平的發(fā)展，疫苗消除了許多傳染病的感染與影響。同樣，為慢性流行的動脈粥樣硬化疾病開發(fā)疫苗也具有重要意義。本文討論了特異性和非特異性免疫系統(tǒng)在動脈粥樣硬化進程中的雙重作用，總結了通過接種疫苗誘導動脈粥樣硬化相關抗原特異性免疫反應以及在實驗模型中延緩動脈粥樣硬化進程的抗原種類。通過自身抗原誘導免疫反應能有效地了解特異性免疫和非特異性免疫對于免疫受體識別和抗體表達的關系，從而為治療動脈粥樣硬化提供指導，并為其他心血管疾病如缺血性心臟病、腦卒中等疾病治療提供參考。

然而，動脈粥樣硬化疫苗的開發(fā)仍面臨不少挑戰(zhàn)。包括：（1）疫苗安全和穩(wěn)定性的問題，確保疫苗可適當復制天然抗原，并確保免疫反應有適當?shù)膹姸群唾|量從而提供有效的機體保護；（2）免疫療程和持久性；（3）臨床研究中的療效終點的確定和監(jiān)測；（4）縮短候選疫苗的開發(fā)時間、生產和臨床應用；（5）成本投入巨大。像所有疫苗一樣，動脈粥樣硬化疾病疫苗的免疫反應也很難預測，開發(fā)出最佳疫苗需要長期耗時的動物疫苗免疫實驗，然后表征所得的免疫結果，從而判斷疫苗優(yōu)劣；此外，物種差異造成疫苗的臨床使用更加困難，有些疫苗在動物實驗中表現(xiàn)良好，但在人體使用卻無效（表3）。考慮到所有這些挑戰(zhàn)，對動脈粥樣硬化疫苗未來臨床應用保持謹慎樂觀。

表3 部分疫苗臨床研究進展

目前，有許多可應用于人體的抗原選擇，很多很有希望的結果都是在臨床前實驗中得到的，將這一疫苗治療手段運用到臨床研究中顯得至關重要與緊迫。但將上述臨床前觀察轉化為臨床領域仍處于起步階段，例如，許多臨床前試驗已經確定LDL 在動脈粥樣硬化形成中的作用，這使LDL 和ApoB-100成為免疫調節(jié)治療的初始靶標，但到目前為止，還沒有針對此類靶標的藥物上市。