郭躍龍，吳 丹，鄭 楓，紀順利*

（1江蘇省省級機關醫(yī)院藥劑科，南京210024；2中國藥科大學藥物分析教研室，南京210009）

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolides antibiotics，MACs）是一類分子結構中具有12～16 碳內(nèi)酯環(huán)的藥物總稱，主要用于治療需氧革蘭陽性球菌和革蘭陰性球菌感染所引發(fā)的疾病［1］，不良反應包括消化道癥狀、肝毒性、心臟毒性等。日常生產(chǎn)生活中，抗生素常被添加到飼料中促進動物生長，部分沒有代謝的抗生素最終在人體內(nèi)蓄積，進而影響人體健康。許多國家的監(jiān)管機構都制定了食品基質中MACs 的最大殘留限定（MRLs），因此，開發(fā)快速有效的食品基質中MACs 的定量檢測技術非常必要。

MACs 結構中缺乏發(fā)色團，紫外響應弱，不能使用紫外檢測器對含量低的樣品直接定量檢測［2］；此外，食品基質復雜，可能會干擾目標物的檢測。為富集目標物以及屏蔽基質干擾，需要開發(fā)合適的樣品前處理方法。常用的樣品前處理方法有固相萃取［3-4］、基質分散固相萃?。?］、QuEChERS［6］和固相微萃?。⊿PME）等。其中，SPME 是一種集采樣、萃取和濃縮于一體的方法，適用于痕量化合物的提取和凈化。SPME 的核心在于萃取頭，傳統(tǒng)萃取頭以非特異性吸附為主，選擇性、熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性差，因此制備可重復利用、具有良好選擇性和穩(wěn)定性的新型涂層材料是非常值得關注的。

分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIPs）是一種穩(wěn)定性高、具有特異識別功能的新材料，可通過模板分子和功能單體與交聯(lián)劑聚合而獲得。聚合后移除模板分子，會留下特定的空穴，可以根據(jù)大小、形狀和功能基團選擇性地“鎖定”并富集目標化合物，適用于各種復雜樣品的前處理。近年來，報道了多種分子印跡材料對食品樣品中的紅霉素或替米考星進行選擇性富集的材料，諸如磁性分子印跡聚合物［5］、固相萃?。?］和固相微萃?。⊿PME）［8］等。但目前尚無有關熱敏型、可修復的分子印跡固相微萃取纖維（MIPfibers）制備方法的報道。本研究以螺旋霉素為模板分子，N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，硅烷化的石英毛細管為載體合成了具有熱敏型、可修復的、能夠特異性識別MACs 的MIP-fibers，并用其同時檢測食品基質中多種MACs。

1 材 料

1.1 試 劑

替米考星（TILM）、螺旋霉素（SPI）、交沙霉素（JOS）、泰樂菌素（TYL）（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；阿奇霉素（AZI）、克拉霉素（CLA）、羅紅霉素（ROX）（中國食品藥品檢定研究院）；磺胺嘧啶（美國Alfa Aesar 公司）；鹽酸土霉素、恩諾沙星、偶氮二異丁腈（美國Sigma-Aldrich 公司）；3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（美國Acros 公司）；N-異丙基丙烯酰胺（上海麥克林生化科技有限公司）；甲基丙烯酸（MAA）、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、乙二醇甲基丙烯酸酯（中國上海阿拉丁試劑有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純。實驗用水由Milli-R04凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得。

1.2 儀 器

Alliance 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；FESEM NOVA NanoSEM450 掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）；TriStarII3020TM比表面積和孔體積分析儀（美國Micromeritic公司）。

2 方 法

2.1 溶液配制

準確稱取適量7 種MACs 標準品，用甲醇-水（20∶80）溶解并定容，配制成1 mg/mL 的標準儲備液，于4 ℃冰箱中保存，在使用前用20 mmol/L K2HPO4溶液（pH 7.4）稀釋定容制成混合標準工作液。恩諾沙星、磺胺嘧啶和鹽酸土霉素除用甲醇溶解外，其余處理方法均與MACs相同。

2.2 MIP-fibers的制備

截取長約4 cm 的石英毛細管（50 μm × 365 μm），火燒去除一半長度的外壁保護層。將毛細管依次浸泡在1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 溶液中、去離子水洗至中性后氮氣吹干。毛細管硅烷化過程參照文獻［9］中方法：將上述毛細管浸泡在3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷-丙酮（1∶9）溶液中2 h后，100 ℃下干燥2 h。

熱敏型MIP-fiber 參照文獻［10］中的最佳實驗條件制得：稱取SPI 0.1 mmol、甲基丙烯酸0.42 mmol、N-異丙基丙烯酰胺0.4 mmol 溶于二甲基亞砜-氯仿（1∶2）溶液3 mL 中，混合均勻后加入乙二醇甲基丙烯酸酯2 mmol和偶氮二異丁腈10 mg，即得預聚合物溶液。將毛細管硅烷化的一端插入2 cm 長的玻璃管（0.9～1.1 mm）后，放進4 mL 的離心管中，加入制備好的預聚合物溶液，60 ℃水浴條件下反應24 h。待反應結束后，將毛細管從玻璃管中推出，即得MIP-fiber。將MIP-fiber 浸入乙酸-甲醇（1∶4）中，渦旋5 min 后去除模板分子后保存在甲醇中，待后續(xù)實驗使用。

非印跡固相微萃取纖維（NIP-fibers）的制備過程中不加入SPI，其余合成步驟與MIP-fibers相同。

2.3 色譜條件

MACs 是一種堿性抗生素，用普通的C18色譜柱通常會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因此選用表面帶正電荷的Acchrom XCharger-C18型反相色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）來解決該問題。流動相：乙腈（A），0.02% 磷酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～9 min，A 相從5% 到44%；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長：通道1（283 nm），通道2（232 nm），如圖1。

Figure 1 Separation of 4 macrolides antibiotics（MACs）A:Spiramycin (SPI);B:Josamycin (JOS);C:Tilmicosin (TILM);D:Tylosin(TYL)

2.4 樣品預處理

用4 種不同來源的蜂蜜樣品來評價MIP-fiber的富集效果，選擇洋槐花蜂蜜作為空白樣品（經(jīng)檢測該蜂蜜不含目標抗生素）。樣品預處理方法如下：稱取空白樣品2 g（精確至0.01 g），置于10 mL離心管中，加入20 mmol/L K2HPO4（pH 7.4）緩沖溶液5 mL，充分渦旋混合30 s 后，以4 500 r/min 離心10 min，收集上清液，作為SPME上樣液。

2.5 凈 化

凈化流程如圖2 所示：將制備好的萃取纖維（MIP-fiber 或NIP-fiber）浸沒在樣品溶液中，500 r/min 下攪拌60 min。然后將纖維取出，用乙腈-水（1∶4）1.5 mL 淋洗，最后采用渦旋法45 ℃條件下洗脫2 min，洗脫液為乙酸-乙腈（1∶4）1.5 mL。洗脫液氮氣吹干后，用甲醇-水（1∶4）200 μL 復溶，進行紫外檢測。

3 結果與討論

3.1 去除模板分子

去除模板分子是制備分子印跡材料中最關鍵的一步，但是通常存在耗時較長和難去除徹底的問題，為此，以甲醇-乙酸（8∶1）作為洗脫液，測試了兩種不同的去模板方法。（1）振蕩法：將3～5 根MIP-fiber放進加有洗脫液的離心管中，以200 r/min的條件振蕩24 h，每8 h 更換一次洗脫液。該方法可有效去除SPI，但所需時間長，在振蕩過程中纖維之間的摩擦容易造成MIP 材料的損失。（2）渦旋法：采用相同的洗脫液渦旋洗脫5 min，重復該洗脫過程直至無模板被檢出。采用該方法使得萃取纖維在洗脫液中高速旋轉，可快速去除模板分子且不會損失涂層材料，所以選擇渦旋法去除模板分子。

3.2 MIP-fibers制備條件的優(yōu)化

分別以MAA、丙烯酰胺（AM）、4-乙烯基吡啶（4-VP）為功能單體，改變模板與功能單體之間的物質的量比制備5 種MIP-fibers，將制得的MIPfibers 分別放入20 μg/mL SPI 溶液5.0 mL 中，45 ℃水浴條件下萃取120 min 后使用高效液相色譜法測定溶液中SPI 的濃度，結果如表1 所示，可以看出MAA 作為單體時的吸附能力最強；模板分子與MAA 的物質的量比為1∶4.2 時達到最大吸附量82.5%。

3.3 表 征

圖3-A 為MIP 反應前后毛細管的對比照片，經(jīng)MIP 反應后，毛細管外可見均勻的印跡聚合物涂層。MIP-fiber 和NIP-fiber 的掃描電子顯微鏡照片（SEM）如圖3 所示，相較于NIP（圖3-C），MIP（圖3-B）具有更多的孔隙結構和更高的交聯(lián)度，因此具有更大的表面積，從而有較高的吸附容量。MIPfiber干燥狀態(tài)下的SEM如圖3-D所示，可以觀察到許多斷層，說明聚合物材料在干燥環(huán)境和溶液中的柔韌性不同，這與實際應用過程中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象是一致的。有趣的是將干燥后斷裂的MIP-fibers浸泡在甲醇溶液中一段時間后，纖維上的斷層消失，恢復到剛制備出來的形態(tài)。因此，判斷MIPfibers有自修復功能。

Table 1 Optimization of functional monomer

采用氮氣吸附孔隙度測定法測定MIP/NIP 材料的比表面積和孔容，MIP、NIP的比表面積分別為130.928、1.761 m2/g，孔 容 分 別 為0.294、0.017 cm3/g。與SEM 檢測所得到的結果相同，MIP 材料的比表面積遠遠大于MIP 材料，這充分說明所制備的MIP-fiber非常適合于樣品前處理。

Figure 3 Photographs and SEM images of molecular imprinting polymer(MIP)-fiber and non-imprinting polymers (NIP)-fiberA:Fibers after molecular imprinting (1) and before molecular imprinting(2);B:Morphology of MIP-fiber;C:Morphology of NIP-fiber;D:SEM image of MIP-fiber in dry condition

3.4 靜態(tài)吸附和吸附動力學實驗

吸附容量和速率是影響固相微萃取吸附劑性能的重要因素。

3.4.1 靜態(tài)吸附實驗 分別將一根MIP-fiber/NIP-fiber 放入裝有30～900 μg/mL SPI 溶液5 mL的離心管中，密封后45 ℃水浴條件下攪拌24 h。HPLC-UV 測定溶液中SPI 的殘留量，并根據(jù)公式（1）計算MIP-fiber/NIP-fiber吸附容量。

其中：c（mg/mL）、ct（mg/mL）分別代表SPI 初始、結束時的質量濃度；V（mL）代表樣品體積；m（g）代表涂層質量。

得到結果如圖4-A 所示，在SPI 濃度較低時二者差異很小，隨著初始溶液中SPI 濃度的增加，二者的吸附量都有所提高，但是MIP-fiber 比NIPfiber 提高得更明顯，表明MIP-fiber 的吸附性能優(yōu)于NIP-fiber。

3.4.2 吸附動力學實驗 將一根MIP-fiber/NIPfiber 放入100 μg/mL SPI 溶液25.0 mL 中，密封后45 ℃水浴條件下攪拌240 min，分別在1、5、10、15、20、25、60、90和240 min時進行取樣，檢測SPI的濃度。得到結果如圖4-B 所示，MIP-fiber 在60 min 內(nèi)達到吸附平衡，NIP-fiber 在240 min 后仍未達到吸附平衡，表明MIP-fiber具有更穩(wěn)定的吸附性能。

Figure 4 Adsorption isotherms (A) and adsorption kinetic (B) curves of SPI on MIP-fibers and NIP-fibers (n=3)

3.5 萃取條件的考察

固相萃取通常包括萃取、淋洗和洗脫3 步，為了得到最佳富集效果，本研究對幾個可能影響萃取效率的參數(shù)進行了優(yōu)化。除特殊說明外，其他樣品處理及固相微萃取條件均采用“2.4”和“2.5” 項中方法，并重復操作3次。

3.5.1 溫度的影響 由于N-異丙基丙烯酰胺和MAA的加入，使得MIP-fiber同時具有pH和溫度響應的立體選擇性。其根本原因為溫度會改變MIP聚合物內(nèi)部孔道的大小，使得MIP-fiber 在較低溫度下膨脹，在較高溫度下收縮，從而與目標化合物的匹配程度不同。為此研究了MIP-fiber 在不同溫度下對4種MACs的吸附情況，結果如圖5-A 所示，驗證了以上結論，同時在45 ℃時MIP-fiber 與模板分子SPI的匹配程度最高，因此在后續(xù)試驗中采取45 ℃作為萃取溫度。

3.5.2 pH 的影響 蜂蜜溶液的pH 在3 附近，因此本實驗選擇pH 為3～10 的K2HPO4緩沖鹽溶液（20 mmol/L）對蜂蜜進行稀釋后進行萃取，結果如圖5-B 所示。萃取體系pH 逐漸升高，4 種MACs 的萃取效率均呈現(xiàn)“先升后降”趨勢，并在pH 7.4 時達到最高，因此，后續(xù)實驗中，使用pH 為7.4 的K2HPO4溶作為蜂蜜的稀釋溶液。

3.5.3 淋洗條件 良好的淋洗溶液可以在不影響目標物回收率的前提下洗去非特異性保留的物質，從而達到屏蔽基質及其他雜質干擾的目的。本研究使用4 種不同的淋洗溶液，結果如圖5-C 所示，4種淋洗溶液均會對目標物造成一定的損失，但去離子水和乙腈淋洗后損失較少，分別損失0.15%和4.46%。因此進一步研究了乙腈與水不同比例時對MACs 回收率的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（1∶4）溶液能有效消除基質干擾，且無MACs的損失。最終選擇乙腈-水（1∶4）作為后續(xù)實驗的淋洗溶劑。

3.5.4 洗脫條件 為了盡量將目標物完全洗脫，從而得到滿意的回收率，對洗脫溶液的種類及比例進行了考察。選取甲醇、丙酮、乙醇和乙腈4 種洗脫溶液，結果發(fā)現(xiàn)使用乙腈溶液進行洗脫效果最好；進一步考察了乙腈中乙酸比例的影響，洗脫液中待測物峰面積如圖5-D 所示，乙酸含量在0%～20% 之間時，增加乙酸用量可提高洗脫效果，并在20%時達到最大值，因此選擇乙酸-乙腈（1∶4）作為后續(xù)實驗的洗脫溶液。

Figure 5 Effect of temperature（A）, pH(B)，eluent（C）and percentage of acetic acid（D）on solid-phase microextraction（SPME）efficiency (n=3)

3.6 富集倍數(shù)測定

固相微萃取的富集原理是目標物在樣品基質和吸附層之間達到分配平衡，因此溶液中目標物的質量濃度會影響萃取效率。本研究控制SPI 總量為10 μg，配制體積分別為5、20、200 mL 3 種不同質量濃度的溶液，探究在不同質量濃度下MIPfiber/NIP-fiber 對目標物的富集效果，目標分子的富集因子EF通過公式（2）計算得到：

其中：c0和c1分別為標準溶液直接進樣的質量濃度及富集前樣品溶液的質量濃度；A0和A1分別為直接進樣得到的峰面積及富集后的峰面積大小。

結果見圖6，可以看出MIP-fiber 對MACs 具有較好的富集濃縮能力，尤其是在低濃度條件下，MIP-fiber的富集效果明顯優(yōu)于NIP-fiber。

3.7 選擇性實驗

為了驗證MIP-fiber 可以對MACs 進行特異性選擇，選取SPI 和蜂蜜中常被檢測到的3 類非大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（磺胺嘧啶、恩諾沙星、鹽酸土霉素）添加到基質中進行測試。3 類非大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的濃度均為5 mg/kg，SPI 的濃度為0.5 mg/kg。實驗結果如圖7 所示，使用MIP-fiber 富集后，3 種非大環(huán)內(nèi)酯類抗生素峰響應不升反降，說明MIPfiber 對以上干擾物幾乎無富集作用，但對SPI 的富集效果非常好。在某種程度上確認了MIP-fiber 上存在特異性識別位點，可以選擇性富集目標物、降低雜質效應、排除基質干擾。

3.8 線性范圍與檢出限

Figure 6 Effects of loading volume on the extraction efficiencyInset:Chromatogram of (A) injection after SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample),(B) 10 μg/mL spiramycin standard solution,and (C) direct injection without SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample)

為了驗證MIP-HPLC-UV 檢測方法的可行性，在蜂蜜樣品中制備一系列含不同濃度的SPI、JOS、TYL 和TILM 的基質匹配混合標準溶液。如表2 所示，在0.5～50 μg/mL的線性范圍內(nèi)，該方法對4種MACs均表現(xiàn)出良好的線性，相關系數(shù)r2高于0.99。在抗生素殘留分析中，方法的靈敏度通常表示為檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。在這項研究中，以特征色譜峰的信噪比S/N ≥3 和S/N ≥10 分別為方法的LOD 和LOQ，4 種MACs 的LOD 范圍為23.8～85.4 μg/kg，而LOQ范圍為79.2～284.5 μg/kg。

3.9 方法應用

采用MIP-HPLC-UV法對當?shù)刭徺I的蜂蜜樣品進行檢測，4 種蜂蜜中均未檢測到MACs。為了驗證檢測方法的正確性，本研究在蜂蜜樣品中進行1.25、12.5和125 mg/kg 3個濃度的加標試驗，結果如表3 所示，目標化合物的回收率（81.8%～119.1%）較好，日間精密度小于13.8%（n=6），日內(nèi)精密度小于15.5%（n=3），回收率高、重復性好，可用于蜂蜜樣品中MACs的測定。

Figure 7 Selectivity of MIP-fibers to non-macrolide antibiotics and macrolide antibioticA:Enrofloxacin;B:Oxytetracycline hydrochloride;C:Sulfadiazine;D:Spiramycin (a is direct injection and b is the eluted fraction after SPME treatment)

Table 2 Linear range,LODs and LOQs of MACs by HPLC-UV (n=3)

Table 3 Precision and reproducibility of MACs

3.10 液質聯(lián)用方法驗證

上述結果已經(jīng)證明了MIP-HPLC-UV可以用于檢測蜂蜜中MACs的含量以及MACs是否存在超標問題。由于大多數(shù)MACs 紫外響應非常弱，上述方法無法實現(xiàn)多種痕量MACs 的同時定量檢測。因此本研究進一步發(fā)展了基于MIP-fiber的7種MACs的液質聯(lián)用（HPLC-MS/MS）定量方法，線性范圍和檢測限如表4所示，更低的檢測限和線性范圍填補了HPLC-UV的空白，使用者可以根據(jù)自身條件、目的及要求對儀器進行選擇。

Table 4 Calibration curves,LODs and LOQs of macrolide antibiotics by HPLC-MS/MS (n=3)

采用所開發(fā)的MIP-HPLC-MS/MS 法對上述4 種蜂蜜樣品的檢測結果如表5 所示，僅樣品4（洋槐花蜂蜜）中未檢測到MACs，其他3種蜂蜜中均含有不同濃度的MACs，但均未超過國家限定標準。

4 結 論

本研究合成了一種具有pH 和溫度響應的MIP-fibers，建立了一種快速、高效測定蜂蜜樣品中MACs 的方法。該纖維具有一定的自修復功能，對MACs 具有良好的吸附性和選擇性，可采用渦旋法快速去除模板和洗脫目標物。樣品預處理簡單、經(jīng)濟、節(jié)省溶劑、節(jié)約時間，為分析蜂蜜樣品中痕量MACs 的殘留提供了一種有效的方法。同時該MIP-fibers 對MACs 具有較好的富集濃縮能力，適用于大體積樣品的現(xiàn)場采樣及富集濃縮，將其與液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用可實現(xiàn)痕量MACs 的高靈敏檢測，后續(xù)實驗中也將進一步拓展該材料的應用。

Table 5 Result of the proposed method for honey samples