穆釗坤 林華林 周加義 王修啟

（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院國家生豬種業(yè)工程技術研究中心 廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東廣州510642）

我國是世界最大的養(yǎng)豬大國，豬肉產(chǎn)量超過全球的1/2。然而我國養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效率只有歐美發(fā)達國家的60%～70%[1]。農(nóng)村農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)顯示，2016年我國每頭母豬每年所能提供的斷奶仔豬頭數(shù)（PSY）約為17 頭，個別規(guī)?；B(yǎng)豬企業(yè)為23～24 頭，與國外先進水平存在較大差距。其主要原因在于我國生豬養(yǎng)殖中仔豬腹瀉率高達50%～60%，死亡率為15%～20%[2]。為防控仔豬腹瀉，我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中長期大量使用抗生素?？股氐臑E用加速了耐藥菌株的產(chǎn)生，造成了豬肉中抗生素的嚴重殘留，引起了生態(tài)環(huán)境的污染[3]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018 年13 號文件—《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018—2021 年)》明確表示藥物飼料添加劑將在2020年全部退出。

后抗生素時代，養(yǎng)豬業(yè)面臨無抗可用的境地，如何解決仔豬健康問題成為研究者和畜牧工作者關注的焦點問題。除繼續(xù)加強和規(guī)范仔豬管理外，營養(yǎng)與健康的關系又被重新審視和評估。研究表明，益生菌、抗菌肽以及某些功能性氨基酸等均具有緩解仔豬腹瀉或促進仔豬生長的作用[4-7]。本文總結(jié)了仔豬腹瀉誘因及其營養(yǎng)調(diào)控的研究進展，為防治仔豬腹瀉和建立抗病促生長營養(yǎng)調(diào)控技術提供參考。

1 仔豬腹瀉

腹瀉是造成仔豬生長發(fā)育受阻和死亡的主要原因，一般包括營養(yǎng)性腹瀉和病理性腹瀉，后者又分為病毒性腹瀉、細菌性腹瀉和飼料源霉菌毒素性腹瀉。雖然腹瀉的誘因是多方面的，但它的本質(zhì)都是腸道離子通道的改變引起水和電解質(zhì)吸收和分泌功能的紊亂，且均會導致腸道結(jié)構(gòu)和功能受損以及微生態(tài)失調(diào)[8]。因此，保障腸道健康是提高仔豬存活率的關鍵。

1.1 病毒性腹瀉

引起仔豬病毒性腹瀉的主要病毒有豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）和豬輪狀病毒（Porcine Rotarvirus，PoRV），它們都會引起仔豬滲透性腹瀉，導致小腸腸壁變薄，腸絨毛萎縮[9]。PEDV 感染腸道的主要靶點是小腸上皮細胞[10]，通過直接膜融合將PEDV 內(nèi)化到細胞中誘導細胞溶解性急性壞死。李任峰等[11]觀察到，在PEDV 侵襲的仔豬回腸絨毛M 細胞（Microfold cell）中存在PEDV 顆粒，而M 細胞是黏膜免疫系統(tǒng)中抗原進入黏膜相關淋巴組織的主要“門戶”，它的死亡會導致高效的腸黏膜免疫應答能力顯著降低，在十二指腸和空腸絨毛則沒有觀察到此現(xiàn)象，這可能提示回腸是PEDV 的主要作用部位。Li 等[12]同樣發(fā)現(xiàn)，PEDV 感染會引起10 日齡仔豬嚴重的萎縮性回腸炎。然而，來源于仔豬十二指腸、空腸和回腸的隱窩干細胞擴增而成的類腸團均易受PEDV 感染，且包括腸道干細胞、吸收細胞和杯狀細胞在內(nèi)的多種類型細胞都為陽性。目前并沒有文獻對體內(nèi)外PEDV 感染試驗呈現(xiàn)出的差異做出合理的解釋。雖然類腸團模型可一定程度上模擬體內(nèi)研究，但是腸道結(jié)構(gòu)和功能畢竟要復雜得多，再加上腸腔中數(shù)以十萬億計的微生物與腸細胞的共生互作，因此離體水平可能無法產(chǎn)生與體內(nèi)水平PEDV 感染一致的生物信息。此外，在PEDV 感染的早期，腸細胞干擾素（IFN）的含量顯著減少，表明PEDV 具有調(diào)節(jié)宿主先天性免疫應答的能力[13]；PoRV 能夠有效感染腸上皮細胞，在黏附于小腸上皮細胞后產(chǎn)生腸毒素，可特異性誘發(fā)細胞內(nèi)Ca2+升高和Cl-分泌，導致腹瀉[14]。Zou等[15]發(fā)現(xiàn)，低活力的PoRV 可感染并損傷終末分化成熟的腸細胞，破壞宿主分泌途徑，導致刷狀邊界酶定位錯誤，腸道吸收功能障礙，細胞通透性增加，進而誘導腸細胞死亡。但是在PoRV 感染期間，活躍型和儲備型腸道干細胞群都得以保留。這些腸道干細胞，尤其是隱窩基底部的Lgr5+（Leucinerichrepeat-containing g-protein-coupled receptor 5）干細胞的增殖、遷移和分化會促進腸上皮再生，且此過程依賴于Wnt 信號的參與。

1.2 細菌性腹瀉

仔豬細菌性腹瀉病原主要包括大腸桿菌和致病性沙門氏菌等。大腸桿菌大致可分為致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)。EPEC 毒力基因主要位于腸細胞脫落位點致病島（毒力相關的DNA 序列）上，可編碼III 型分泌系統(tǒng)（Type IIISecretion System，T3SS）、轉(zhuǎn)運緊密黏附素受體（Translocatedintiminreceptor, Tir）和大腸桿菌分泌蛋白（Ecolisecretedproteins, Esp）等，造成腸上皮細胞肌動蛋白的解聚和細胞骨架的破壞，引起典型的黏附和脫落（Attaching and Effacing,A/E）組織病變[16-17]。Gill 等[18]研究表明，EPEC 可通過抑制Cl-/OH-交換活性，降低腸道上皮細胞對Cl-的吸收，進而導致腹瀉。究其原因，主要是因為EPEC 能通過T3SS將毒力因子注入宿主細胞中產(chǎn)生毒力效應。這些毒力因子包括EspF、EspG、EspH 和Map，其中EspG能破壞宿主微管網(wǎng)絡，而只有完整的微管網(wǎng)絡才能完成Cl-/OH-交換[19]。雖然EspF、EspG 和Map 不影響Cl-/OH-交換活性，但是EspF 能破壞細胞間的緊密連接，EspH 能改變宿主細胞骨架，Map 能改變線粒體膜電位[20-22]；ETEC 能在小腸上皮細胞定植，產(chǎn)生不耐熱腸毒素（LT）和/或耐熱腸毒素（ST），LT 能激活腺苷酸環(huán)化酶，促使環(huán)腺苷酸（cAMP）濃度升高，進而激活氯離子通道，打破腸道上皮細胞的滲透壓平衡，引起水和電解質(zhì)大量進入腸腔，從而導致分泌性腹瀉[23]。ST 在結(jié)構(gòu)上與旁分泌激素鳥苷酸環(huán)化酶激活因子2B（Guanylate Cyclase Activator 2B, GUCA2B）同源，且相較于GUCA2B對鳥苷酸環(huán)化酶2C（Guanylate Cyclase 2C, GUCY2C）受體具有更高的親和力，因而導致GUCY2C 過度激活。GUCY2C 將三磷酸鳥苷（Guanosine Triphosphate, GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（cyclic Guanosine Monophosphate, cGMP），刺激cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent Protein Kinase,PKG）表達，進而打開囊性纖維化跨膜電導受體（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR），誘導氯離子沿其電化學梯度流向腸腔，進一步引起水的分泌，導致滲透性腹瀉[23]。本實驗室體內(nèi)外研究表明，STp 可誘導腸道干細胞“囊腫”化，抑制類腸團出芽，降低Wnt/β-catenin 信號通路活性[24]。而Smith 等[25]發(fā)現(xiàn)，Bmi1+（Bcell specific moloney murine leukemia virus insertion site 1）干細胞體外培養(yǎng)可形成“囊腫狀”類腸團，而Lgr5+干細胞體外培養(yǎng)可形成“芽狀”類腸團。這提示STp 可能誘導了不同類型的腸道干細胞之間的轉(zhuǎn)變。

沙門氏菌主要作用于小腸，它不僅能黏附于腸道上皮細胞，通過T3SS 向細胞中注入效應蛋白，從而抑制腸道免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥的發(fā)生[26]。同時沙門氏菌還能分泌腸毒素，刺激環(huán)化酶體系，促進腸液大量分泌，引起分泌性腹瀉[27]。Zhang 等[28]利用沙門氏菌侵染類腸團，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌破壞了腸上皮細胞的緊密連接，降低腸道干細胞標記Lgr5 和Bmi1 的表達量。

1.3 飼料源霉菌毒素性腹瀉

霉菌毒素是由曲霉菌、青霉菌以及鐮刀菌等不同類型真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于飼料中，對畜禽健康造成嚴重威脅，其中豬對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2 毒素和嘔吐毒素等最為敏感[29]。霉菌毒素進入仔豬體內(nèi)會導致其肝臟受損，膽汁分泌減少，乳汁或飼料中的脂肪無法被消化吸收。腸細胞為維持內(nèi)外滲透壓，分泌過多水分進入腸腔中，從而引發(fā)仔豬滲透性腹瀉[30]。大量研究表明，霉菌毒素會誘導腸黏膜屏障功能損傷，破壞腸道微生物菌群穩(wěn)定性，引起腸道炎癥[31-33]。本課題組發(fā)現(xiàn)，單次灌胃0.3 mg/kg BW 嘔吐毒素即可導致仔豬隱窩干細胞活性下降，而2.0 mg/kg BW 嘔吐毒素處理4 周齡小鼠5～7 d 顯著減少了空腸中杯狀細胞和潘氏細胞的數(shù)量，下調(diào)了隱窩和類腸團中腸道干細胞增殖和分化標志物的表達，且Wnt/β-catenin 信號通路介導了此過程[34-36]。

1.4 營養(yǎng)（生理）性腹瀉

仔豬從母體到獨立都會經(jīng)歷斷奶階段，斷奶應激往往導致仔豬腸上皮細胞吸收功能障礙，從而引起滲透性腹瀉[37]。且仔豬斷奶由于其營養(yǎng)供給從富含蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖的高消化率母乳轉(zhuǎn)變?yōu)橄瘦^低的以淀粉為基礎的飼糧，導致其能量攝入量不足，難以維持腸上皮的有序結(jié)構(gòu)[38]。斷奶應激誘導腸上皮細胞損傷，而線粒體作為細胞代謝的中樞，是損傷作用的主要靶細胞器[39]。在正常細胞中，線粒體整合了能量產(chǎn)生和生物合成的分子途徑，維持氧化還原平衡[40]。斷奶應激引起線粒體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸的損傷，導致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，造成腸上皮細胞死亡[41]。

2 藥物飼料添加劑的使用和濫用

不可否認，抗生素作為飼料添加劑應用于畜牧生產(chǎn)后，有效降低了畜禽疾病發(fā)生率，極大推動了畜牧業(yè)的發(fā)展。然而，由于不規(guī)范用藥導致的抗生素殘留對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了嚴重威脅。據(jù)統(tǒng)計，我國每年生產(chǎn)的抗生素有超過四成用于畜牧業(yè)，其中90%的抗生素作為飼料添加劑，10%用作治療畜禽疾病，從而導致大量肉制品、乳制品中檢測出各種抗生素及其代謝產(chǎn)物，包括人畜共用型藥物以及明令禁止的藥物[42]。面對當前嚴峻形勢，我們必須從大局出發(fā)做出抉擇。而早在1986 年，瑞典便基于食品安全的考慮，規(guī)定禁止在飼料中添加抗菌促生長劑（Antibacterial Growth Promoters，AGPs）。1999年，歐盟規(guī)定飼料中只能使用阿維拉霉素、鹽霉素、黃霉素和莫能菌素，隨后在2006 年全面禁止所有抗生素的使用[43]。2000 年丹麥宣布畜禽料中禁用抗生素，2011年韓國頒發(fā)禁用通知，2017年美國飼料中停止使用人類抗生素。緊隨其后，我國也在2018 年將藥物添加劑退出的時間定在了2020年。這一歷史性決定提醒所有畜牧人需整合創(chuàng)新，迎接后抗生素時代的到來。

3 腸道健康調(diào)控

面對后抗生素時代的巨大挑戰(zhàn)，許多致力于畜牧業(yè)的研究人員都在試圖尋找有效的替抗策略。四川農(nóng)業(yè)大學陳代文教授提出“抗病”營養(yǎng)的概念，且這一概念不斷被試驗所證實，如益生菌、抗菌肽和某些功能性氨基酸等。對這些營養(yǎng)源或營養(yǎng)素功能的挖掘有助于促進仔豬腸道發(fā)育，降低仔豬腹瀉率。

3.1 益生菌

畜禽腸道中寄宿著數(shù)目龐大、種類眾多的微生物，而菌群之間的平衡是維系腸道健康極為重要的一環(huán)。研究證實，飼料中添加益生菌制劑，如丁酸梭菌和乳酸桿菌，可有效改善仔豬腸道微生物菌群，恢復宿主免疫系統(tǒng)，降低疾病發(fā)生率[44]。丁酸梭菌又名酪酸梭狀芽孢桿菌，在腸道中具有高黏附的特性，能競爭性抑制有害菌和腐敗菌的生長，減少腸毒素的發(fā)生。同時，丁酸梭菌的主要代謝產(chǎn)物——丁酸可為腸細胞的正常生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，促進腸上皮組織的再生和修復[45]。另有研究報道，丁酸梭菌能夠產(chǎn)生抗菌肽等抗菌物質(zhì)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。趙熙等[46]在小鼠腸道中植入丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量增加，而有益菌群的增加占據(jù)更多的腸上皮位點，壓縮了有害菌的生存空間。

乳酸桿菌作為益生菌被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖、食品保健和臨床治療中。大量試驗證實，乳酸桿菌能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、增強腸道屏障功能和調(diào)節(jié)腸道免疫力，從而改善腸道健康，促進機體生長[47-48]。這些功能的發(fā)揮除依賴于乳酸桿菌自身對病原菌的競爭（包括競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點）和排斥作用外，還與其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)如乳酸、過氧化氫和細菌素有關。乳酸和過氧化氫能分別通過降低腸道pH 值和激活過氧化物酶-硫氰酸鹽反應系統(tǒng)抑制有害菌的生長，而細菌素則通過改變致病菌細胞膜通透性和降低其DNA 的合成發(fā)揮殺菌作用。此外，乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物還能作為信號分子調(diào)控腸上皮細胞活性來增強上皮細胞的屏障功能。Hou 等[49]利用類腸團與黏膜固有層淋巴細胞（Lamina Propria Lymphocytes, LPLs）共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可通過誘導LPLs 分泌白細胞介素22（Interleukin-22,IL-22）激活STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）信號，進而促進腸道干細胞再生，保護腸黏膜的完整性。

3.2 抗菌肽

抗菌肽（AMPs）是一種天然存在的小分子肽類，具有廣譜抗菌活性，且不易產(chǎn)生耐藥性。研究表明，日糧添加抗菌肽可有效改善腸道上皮結(jié)構(gòu)和屏障功能，緩解斷奶仔豬腹瀉，提高斷奶仔豬生長性能?？咕牡陌ご┩噶κ瞧浒l(fā)揮抑菌作用的主要途徑，而其破膜的方式還存在爭議。目前認為至少存在“環(huán)孔、毯式、桶板和聚集體”四種模型。此外，有研究指出，部分抗菌肽可直接進入細菌內(nèi)部，阻礙DNA和蛋白質(zhì)的合成，降低胞內(nèi)必需酶的活性，從而導致菌體的死亡[50]。Yu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽還具有免疫調(diào)節(jié)作用，降低過度的炎癥反應，增強腸道屏障功能，修復腸上皮細胞損傷。

3.3 功能性氨基酸

近年來，包括谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、谷氨酸（Glutamate，Glu）、蛋氨酸（Methionine，Met）和精氨酸（Arginine，Arg）等功能氨基酸被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)腸細胞增殖、凋亡和分化活性，促進腸上皮更新和再生作用。Sukhotnik等[52]利用甲氨喋呤（Methotrexate，MTX）構(gòu)建化療性大鼠腸道炎癥模型，發(fā)現(xiàn)補充Gln能顯著增加模型鼠空腸和回腸黏膜重量、絨毛高度以及增殖細胞數(shù)量，提高黏膜中DNA 含量，上調(diào)TLR4/MyD88（Toll-like Receptor 4/Myeloiddifferentiationfactor 88）表達，表明Gln 通過激活TLR4/MyD88 信號通路促進腸上皮細胞的增殖，從而緩解腸黏膜炎癥，降低MTX誘導的腸黏膜損傷。本實驗室研究表明，添加Glu能增加IR/IRS/PI3K/Akt/mTORC1活性，提高豬腸道干細胞擴增為類腸團的生成效率和出芽指數(shù)[53]。不僅如此，在嘔吐毒素存在的情況下，Glu 仍能重新激活Akt/mTOR/4EBP1 信號通路增強腸道屏障功能[54]。Zhou 等[35]發(fā)現(xiàn)酶解小麥蛋白質(zhì)（富含Gln 和Glu）能促進嘔吐毒素損傷下腸道干細胞的增殖和分化，維持腸上皮的完整性，且Wnt/β-catenin 介導了此過程。同樣，Met 及其羥基類似物HMB 也能通過激活Wnt/βcatenin 信號抵抗嘔吐毒素誘導的腸道干細胞活性降低和腸絨毛萎縮[38]。而用缺少Met的日糧飼喂小鼠會抑制小鼠腸道干細胞的增殖[55]；Arg 則被證實是豬的條件性必需氨基酸，Arg 嚴重缺乏會導致動物高氨血癥甚至死亡[56]。研究表明，斷奶前補充Arg 能增加斷奶后仔豬腸道的消化吸收能力，促進腸道發(fā)育，提高仔豬體重[57]。

4 小結(jié)

藥物飼料添加劑的禁用乃大勢所趨。后抗生素時代，養(yǎng)豬業(yè)如何從“無抗”的陣痛期過渡到“安全、高效、優(yōu)質(zhì)、環(huán)?！钡目沙掷m(xù)發(fā)展期，除繼續(xù)加強仔豬規(guī)范化養(yǎng)殖外，還需要整合和優(yōu)化腸道健康調(diào)控技術，特別是抗病促生長營養(yǎng)理論和技術的開發(fā)和完善。隨著分子生物學、營養(yǎng)學、藥理學和病理學等多學科交叉研究，仔豬腹瀉的發(fā)生和發(fā)展機制逐漸清晰，這有助于對仔豬腸道施行更加精細化、動態(tài)化和具有靶向性的營養(yǎng)調(diào)控，以促進仔豬腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，預防或減少腹瀉等腸道疾病的發(fā)生。