余 行 潘洪彬 程燕東 杜津京 周全江 字玲錦 雷清芝 曹振輝*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

飼料富含蛋白質(zhì)、淀粉、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，且結(jié) 構(gòu)疏松、吸濕性強(qiáng)，因此在一定溫度、濕度條件下，微生物易繁殖而發(fā)生腐敗或霉變[1]。霉變飼料因霉菌大量繁殖產(chǎn)生霉菌毒素（Mycotoxin），對(duì)飼料安全構(gòu)成極大的威脅[2]，霉菌毒素可通過(guò)食物鏈蓄積并威脅人類健康。Park 等[3]研究表明，霉菌毒素能夠通過(guò)破壞腸道屏障、增加腸道通透性、誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p害腸道健康，影響動(dòng)物生產(chǎn)性能的發(fā)揮。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）估計(jì)，全世界每年有數(shù)十億噸糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品受到霉菌污染[4]，給飼料工業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前化學(xué)防霉劑主要應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，主要分為三類:有機(jī)酸防霉劑、有機(jī)酸鹽防霉劑和復(fù)合防霉劑。其中有機(jī)酸防霉劑主要包括苯甲酸、丙酸、乙酸、富馬酸等，具有防霉效果好的特點(diǎn)，但腐蝕性較大[5]。飼料添加化學(xué)防霉劑會(huì)影響適口性，且因藥物殘留、價(jià)格昂貴而不被廣泛采用，與當(dāng)今及未來(lái)對(duì)綠色食品的消費(fèi)需求不符。因此，研發(fā)安全可靠、綠色環(huán)保、功能豐富的飼料防霉劑具有良好的應(yīng)用前景。

植物精油是從芳香類植物或藥用植物的根、莖、葉、花或果實(shí)中提取的具有揮發(fā)性的油狀液體，又稱揮發(fā)油，主要成分含有萜烯類及其衍化物、芳香族化合物和含氮、含硫化物等[6]。大部分植物精油都有殺菌、抑菌[7]、防霉、驅(qū)蟲(chóng)以及抗氧化[8]等功能，被應(yīng)用于食品添加劑、病害防治、殺菌制劑、美容化妝、養(yǎng)生保健等領(lǐng)域。植物精油在動(dòng)物生產(chǎn)中的相關(guān)研究表明，植物精油對(duì)豬、雞、牛等動(dòng)物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善動(dòng)物腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高生產(chǎn)性能等作用[9-10]，但對(duì)飼料防霉效果鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)選取了三種植物精油并進(jìn)行復(fù)配，研究其對(duì)腸道主要致病菌和霉菌的抑制作用以及在顆粒飼料中的防霉效果，以期為減少常規(guī)獸用抗菌藥物使用及飼料防霉劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物精油與顆粒飼料

山蒼子精油(Litsea cubeba extraction oil, LCEO)、肉桂精油(Cassia oil, CO)、生姜精油(Ginger essential oil, GEO)，購(gòu)自吉安市某天然植物有限公司。

肉用仔雞全價(jià)配合顆粒飼料，購(gòu)自昆明某飼料有限公司。日糧組成為:玉米、豆粕、麩皮、石粉、多維、鈣磷、氨基酸、微量元素等。日糧營(yíng)養(yǎng)水平為:粗蛋白≥21%、粗灰分≤7%、粗纖維≤5%、鈣0.8%～1.3%、總磷≥0.6%、氯化鈉0.3%～0.8%、水分≤13.8%、蛋氨酸≥0.45%。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

試劑:無(wú)水硫酸鈉、瓊脂、蔗糖、無(wú)水乙醇、胰蛋白胨等，均由云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室益生菌資源挖掘與利用課題組提供。

培養(yǎng)基:PDA 液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然）；PDA瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值自然)；LB 肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 ml、pH 值7.2）；LB 固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml、pH值7.2）。

儀器設(shè)備:多段可編程培養(yǎng)箱（PGX-2688，寧波東南儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（CS101-2EB，重慶萬(wàn)達(dá)儀器有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DPX-9162，上海?，攲?shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）。

1.1.3 菌株

福氏志賀氏菌[Shigella flexneri CMCC(B) 51592]，購(gòu)自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限司；大腸桿菌（Escherichia coli）K88、大腸桿菌（Escherichia coli）ETEC10、鼠傷寒沙門(mén)氏菌[Salmonella typhimurium CMCC(B) 50115]，由云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，益生菌資源挖掘與利用課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物精油復(fù)配

試驗(yàn)前采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行植物精油提純。將提純后的植物精油4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min后去除無(wú)水硫酸鈉，取上清液，再用0.22 μm 的微孔無(wú)菌濾膜過(guò)濾到棕色瓶，-20 ℃冰箱保存待用。將離心后的三種植物精油按體積比1∶1的比例復(fù)配成精油1（山蒼子精油+生姜精油）、精油2（山蒼子精油+肉桂精油）、精油3（生姜精油+肉桂精油），按1∶1∶1比例復(fù)配成精油4（山蒼子精油+生姜精油+肉桂精油）。

1.2.2 腸道主要致病菌抑制試驗(yàn)

采用瓊脂打孔擴(kuò)散法[11]，檢測(cè)不同精油及其組合對(duì)4種腸道主要致病菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用。4種菌株37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，吸取20 μl 菌液與20 ml 溫度為50 ℃的LB固體培養(yǎng)基劇烈混合后傾注平板。無(wú)菌條件下用4個(gè)內(nèi)徑為8 mm牛津杯打孔，然后在其中3個(gè)孔中加10 μl 同種精油作為平行試驗(yàn)組，在第4 個(gè)孔中加10 μl無(wú)菌水作為對(duì)照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3 霉菌抑制試驗(yàn)

霉菌分離:將自然霉變的20 g 飼料樣品加入到10 ml滅菌生理鹽水中，振蕩得孢子懸浮液，吸取1 ml加入PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d。

采用濾紙片擴(kuò)散法[12]，檢測(cè)精油對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制作用。吸取500 μl、28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的霉菌懸液，加入10 ml 溫度為50 ℃的PDA 瓊脂培養(yǎng)基中迅速混勻后傾注到已用10 ml、2%的瓊脂鋪底的平板中，待培養(yǎng)基液凝固后，將精油浸透的圓形濾紙片放在含菌培養(yǎng)基中央，每組做3 個(gè)重復(fù)，用無(wú)菌水設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組，放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，待出現(xiàn)抑菌圈后，每天定時(shí)測(cè)量3 組抑菌圈直徑，直至其大小不再變化為止。

1.2.4 飼料破壞性存放試驗(yàn)

分別稱取肉用仔雞顆粒飼料1 kg 置于無(wú)菌托盤(pán)中，加入1 ml 精油，充分?jǐn)嚢杌靹?。參照杜莉等[13]的方法進(jìn)行破壞性存放試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)飼料保存期，即將飼料樣品保存在較高的溫度（25～30 ℃）和濕度（75%～78%）環(huán)境中，將飼料輕度霉變的時(shí)間乘以6來(lái)預(yù)測(cè)飼料在常規(guī)儲(chǔ)存條件下的保存期。具體方法為:在1 L的PVC塑料杯子中部放置一個(gè)盛有45 ml水的小塑料杯子，將100 g飼料樣品均勻放置在大杯子中，飼料高度為小杯子高度的一半，然后將大杯子密封，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況并記錄。根據(jù)霉菌菌落生長(zhǎng)情況來(lái)判定飼料發(fā)霉等級(jí)，共分為沒(méi)有霉變(表面無(wú)霉菌生長(zhǎng))、輕度霉變(表面邊緣有少量霉絲生長(zhǎng))、中度霉變(表面有少量散在霉菌)、重度霉變(表面基本長(zhǎng)滿霉菌)、完全霉變(表面霉菌生長(zhǎng)茂密)5個(gè)等級(jí)[14]。根據(jù)輕度霉變時(shí)間，預(yù)測(cè)保存期。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差分析，均值比較采用Duncan's 法。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油腸道主要致病菌的抑制作用

單一植物精油對(duì)主要腸道致病菌的抑制作用如表1所示，與對(duì)照組相比，三種單一植物精油均對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌ETEC10 有抑制作用。肉桂精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油（P＜0.05），生姜精油對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于肉桂精油和山蒼子精油（P＜0.05），肉桂精油對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于山蒼子精油（P＜0.05）。

表1 單一植物精油對(duì)腸道致病菌抑菌圈直徑的影響（mm）

復(fù)配植物精油對(duì)主要腸道致病菌的抑制作用如表2 所示，與對(duì)照組相比，四種復(fù)配精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌ETEC10均有抑制作用。精油1、3、4組對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌K88 的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2 組（P＜0.05）；精油1 組對(duì)福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于精油2、3、4組（P＜0.05），精油3、4 組對(duì)福氏志賀氏菌的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2 組（P＜0.05）；精油4 組對(duì)大腸桿菌ETEC10的抑制作用顯著高于精油1、2、3組（P＜0.05），精油1 組和精油3 組對(duì)大腸桿菌ETEC10 的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2組（P＜0.05）。

表2 復(fù)配植物精油對(duì)腸道致病菌抑菌圈直徑的影響（mm）

2.2 植物精油對(duì)霉菌的抑制作用

單一植物精油對(duì)霉菌的抑制作用如表3所示，與對(duì)照組相比，三種單一植物精油均對(duì)霉菌有抑制作用。肉桂精油對(duì)霉菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油和生姜精油（P＜0.05），山蒼子精油和生姜精油對(duì)霉菌的抑制作用差異不顯著。

表3 單一植物精油對(duì)霉菌抑菌圈直徑的影響（cm）

表4 復(fù)配植物精油對(duì)霉菌抑菌圈直徑的影響（cm）

復(fù)配植物精油對(duì)霉菌的抑制作用如表4所示，與對(duì)照組相比，四種復(fù)配植物精油均對(duì)霉菌有抑制作用。四種復(fù)配植物精油對(duì)霉菌的抑菌圈大小順序?yàn)?精油2組＞精油4組＞精油1組＞精油3組。

2.3 破壞性存放試驗(yàn)中植物精油對(duì)飼料霉變的抑制作用

破壞性存放試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，在密閉容器中且保持較高的溫度和濕度的條件下，空白對(duì)照組在第9 d 發(fā)生霉變，添加山蒼子精油、生姜精油的飼料第10 d發(fā)生霉變，添加精油1、3的飼料在第11 d 發(fā)生霉變，添加肉桂精油的飼料在第12 d 發(fā)生霉變，添加精油2、4的飼料在第13 d發(fā)生霉變。因此，添加精油2、4 可使飼料預(yù)測(cè)保質(zhì)期比空白對(duì)照組多24 d，比肉桂精油多6 d，比精油1、3多12 d，比精山蒼子精油、生姜精油多18 d。

表5 破壞性存放試驗(yàn)飼料霉變時(shí)間及預(yù)測(cè)保質(zhì)期

3 討論

3.1 植物精油對(duì)腸道主要致病菌的抑制作用

大腸桿菌、福氏志賀氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)的動(dòng)物腸道致病菌，能引起腸道疾病，影響動(dòng)物健康，目前多使用抗生素防治。但抗生素的使用導(dǎo)致動(dòng)物腸道菌群紊亂，耐藥菌株產(chǎn)生，影響畜產(chǎn)品安全。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的精油超過(guò)3 000種，其中具有抗菌活性的有1 340 多種，約有300 余種已經(jīng)被開(kāi)發(fā)利用[15]。山蒼子又稱山雞椒、木姜子、山姜子，樟木科姜子屬，其果實(shí)、根、葉、花等部位均可用于提取精油，山蒼子精油主要是從果實(shí)中提取[16]。山蒼子精油具有抗氧化、抗菌和抗炎作用[17]。Nguyen 等[18]研究山蒼子精油對(duì)病原菌抗菌活性的結(jié)果表明，山蒼子精油有較強(qiáng)的殺菌作用，通過(guò)改變細(xì)胞形態(tài)，破壞細(xì)胞膜完整性、通透性，改變類核形態(tài)抑制大腸桿菌生長(zhǎng)。She 等[19]研究表明從7 月份山蒼子中提取的精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌均有抑制活性。本研究中，山蒼子精油對(duì)大腸桿菌ETEC10 的抑菌效果與肉桂精油和生姜精油相當(dāng)（P＞0.05），對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和福氏志賀氏菌的抑制效果與生姜精油抑菌效果相當(dāng)（P＞0.05）。肉桂也稱中國(guó)肉桂，是樟科植物樟屬肉桂的干燥樹(shù)皮，含豐富的揮發(fā)油[20]。Clemente 等[21]對(duì)芥菜和肉桂精油聯(lián)合抑菌研究，發(fā)現(xiàn)兩種精油都能穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜，通過(guò)作用于細(xì)胞靶點(diǎn)發(fā)揮殺菌作用。Amin 等[22]采用圓盤(pán)擴(kuò)散法研究不同精油對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)肉桂精油和百里香精油抑菌活性最高，抑菌直徑為22.5 mm和38.5 mm，這與本試驗(yàn)中肉桂精油對(duì)沙門(mén)氏菌抑制效果顯著(P＜0.05)的結(jié)果具有相同之處。生姜是姜屬植物的新鮮根莖，有百辣辛等名[23]。生姜精油是從生姜根莖中提取，呈淺黃或橘黃色，透明且可流動(dòng)的揮發(fā)性成分，具有特殊的香味[24]。Hossain 等[25]研究生姜精油對(duì)比目魚(yú)致病菌體外抗菌作用，發(fā)現(xiàn)生姜精油對(duì)從比目魚(yú)中分離的Edwardsiella tarda、Photobacterium damselae等5株革蘭氏陰性菌和Lactococcus garvieae、Streptococcus iniae、Streptococcus parauberis 等9 株革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑制作用。Kavas 等[26]研究表明添加1.5%生姜精油可以改善食用包衣的抗菌效果，能減少貯藏過(guò)程樣品中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量。趙露露等[27]研究10 種具有較強(qiáng)抑菌作用的植物提取物及其復(fù)配物對(duì)雞源致病菌（雞大腸桿菌和雞沙門(mén)氏菌）的抑制作用，結(jié)果表明肉桂精油、苦參堿、綠原酸對(duì)雞源致病菌有抑制作用，兩兩復(fù)配或三種植物提取物復(fù)配后對(duì)大腸桿菌的抑制作用并未優(yōu)于單一肉桂精油，本研究中由肉桂精油和山蒼子精油復(fù)配的精油2 組對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌ETEC10 和大腸桿菌你K88 的抑制效果不如單一的肉桂精油和山蒼子精油，其原因可能是肉桂精油與山蒼子精油對(duì)以上常見(jiàn)腸道致病菌的抑菌機(jī)制相同，兩者復(fù)配沒(méi)有發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

3.2 植物精油對(duì)霉菌的抑制作用，以及對(duì)顆粒飼料保質(zhì)期的影響

飼料發(fā)生腐敗或霉變是由微生物大量繁殖引起，霉菌是這類微生物的主體。霉菌毒素是指霉菌在其污染的谷物或飼料中所產(chǎn)生的一類有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重影響[28]，主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬毒素等。黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝物，包括B1、B2、M1、M2等20種類型，黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)，有致癌、致畸和致突變等作用，對(duì)人和畜禽健康危害極大[29]。玉米赤霉烯酮又稱F-2 毒素，是一種雌激素類霉菌毒素，主要危害動(dòng)物生殖系統(tǒng)，降低動(dòng)物的繁殖性能[30]，禾谷鐮孢菌是其主要產(chǎn)毒菌株。嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是禾谷鐮刀菌等糧食病原菌的次級(jí)代謝物[31]，能引起腸道病變，改變腸道屏障[32]，產(chǎn)生免疫毒性[33]，危害人和動(dòng)物的健康。伏馬毒素主要由串珠鐮刀菌和多育鐮刀菌產(chǎn)生的一類有不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯水溶性化合物，主要有伏馬毒素B1、B2 和B3 等[34]，具有神經(jīng)毒性、器官毒性、免疫毒性、致癌性等有害作用，嚴(yán)重危害人畜健康[35]。有研究表明，霉菌毒素能降低豬的生長(zhǎng)性能、免疫功能和繁殖性能[36]。飼料的防霉是保障飼料衛(wèi)生質(zhì)量安全的重要措施。研究表明天然植物精油能夠抑制霉菌生長(zhǎng)。Horváth等[37]以白色念珠菌、近平滑假絲酵母、煙曲霉菌、土曲霉菌、小孢根霉菌、鐮刀菌和傘枝梨頭霉為研究對(duì)象，研究肉桂精油、香茅精油、丁香精油、薄荷精油和百里香精油抗酵母和抗霉菌活性，結(jié)果表明百里香精油、肉桂精油和丁香精油組合抗真菌活性最強(qiáng)。Suhem 等[38]研究發(fā)現(xiàn)氦-氖激光處理的山蒼子精油對(duì)黃曲霉的抑制活性提高80%，能完全抑制自然放置的糙米生長(zhǎng)霉菌至少25 d，沒(méi)有經(jīng)精油和激光處理的糙米在3 d 內(nèi)觀察到霉菌污染。Gómez 等[39]研究在不同環(huán)境條件下，牛至精油和肉桂精油及其主要活性成分香荊芥酚和肉桂醛對(duì)玉米提取液中黃曲霉毒素的抑制作用，結(jié)果表明精油及其主要成分對(duì)真菌生長(zhǎng)和黃曲霉毒素產(chǎn)生有抑制作用。鄔本成等[40]研究肉桂醛和香芹酚等組成的復(fù)合植物精油對(duì)青霉、黑曲霉和根霉的抑菌作用，并以添加不同水平植物精油（0、100、200、300 mg/kg）飼料發(fā)生霉變的時(shí)間估計(jì)精油在飼料防霉方面的功效，結(jié)果表明，植物精油能有效抑制青霉菌和黑霉菌的生長(zhǎng)，飼料中添加植物精油不能明顯延長(zhǎng)其保存時(shí)間。本研究結(jié)果表明，單一植物精油和復(fù)配植物精油均能有效抑制霉菌的生長(zhǎng)，極端試驗(yàn)結(jié)果顯示，植物精油添加到顆粒飼料中能不同程度的延長(zhǎng)顆粒飼料的保質(zhì)期。

4 結(jié)論

山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油等體積復(fù)配，能有效抑制主要腸道致病菌、霉菌的生長(zhǎng)，按1‰比例添加到顆粒飼料中能延緩發(fā)霉時(shí)間，延長(zhǎng)顆粒飼料的保質(zhì)期。