楚 思，范 恒

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖北 武漢 430022

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性、特發(fā)性的腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹痛、腹瀉、血便，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)[1]，近年來IBD在亞洲的發(fā)病率持續(xù)增加[2]。目前IBD的發(fā)病機制尚未完全明確，但歸因于多種因素，包括遺傳易感性、腸道微生物組的改變、先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的缺陷及各種環(huán)境暴露。

目前對IBD的藥物治療主要包括5-氨基水楊酸酯類藥物、類固醇、抗微生物制劑、免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體[3]。但傳統(tǒng)療法頻繁地顯現(xiàn)出各種不良反應(yīng)及耐藥性，尋找替代療法成了迫切需要。近年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展，已經(jīng)應(yīng)用人類干細胞療法來治療包括IBD在內(nèi)的組織相關(guān)性疾病。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是其中應(yīng)用最廣泛的細胞，具有公認的促進受損組織再生和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，因其活躍的增殖和多向分化的潛能，并且能觸發(fā)強大的免疫調(diào)節(jié)和自身的低免疫原性，確保了他們在再生醫(yī)學和免疫干預(yù)療法方面的成功[4]。研究表明，MSCs治療作用的潛在機制除了其定向遷移分化的能力外，更重要的在于其旁分泌作用，除了分泌細胞因子和生長因子，還釋放細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，這些EVs在組織再生和免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色[5]。本文將對MSCs來源的EVs(MSC-EVs)在IBD中的作用作一概述。

1 MSC-EVs

MSCs是成纖維細胞樣祖細胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，可以從骨髓、脂肪、臍帶等不同組織中獲得，可分化成多種不同類型的細胞。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs不表達人類白細胞抗原(HLA)Ⅱ類抗原，導致MSCs在同種異體移植中具有較低的免疫原性[6]。因此MSCs成為再生醫(yī)學和免疫療法中非常重要的細胞來源。最初，人們將MSCs的治療作用歸因于它們能夠遷移并定植到靶向區(qū)域的能力，但許多干細胞移植的研究顯示到達靶區(qū)域的MSCs數(shù)量很有限[7]，且MSCs的無細胞條件培養(yǎng)基和MSCs的分泌組對多種疾病顯示出有益作用[8]。這強烈提示MSCs介導的治療作用可能歸因于它們的分泌途徑而不是其組織歸巢能力。

EVs是由細胞分泌的納米級別的膜性小體(大小范圍為30～1 000 nm)，是在細胞之間穿梭的能夠維持機體生理穩(wěn)態(tài)及影響疾病發(fā)生[9]的重要生物分子[10-11]，根據(jù)來源及形成方式的不同可分為微泡、外泌體和凋亡小體[12]。EVs可以與靶細胞膜融合以釋放其內(nèi)含物，包括miRNA、mRNA、生長因子等進入靶細胞，這被認為是它們的關(guān)鍵生理功能[13]。同時，EVs可能通過細胞因子的分泌或促進炎癥介質(zhì)的表達來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。

研究表明，MSC-EVs在中風[15]、腦外傷[16]、傷口愈合[17]等動物模型中能夠促進再生并具有抗炎特性。最近的研究表明，MSC-EVs發(fā)揮的生物學作用與母體細胞相當[18]，在許多疾病中均展現(xiàn)了與MSCs類似的治療作用[19-20]。使用MSC-EVs作為MSCs的替代品具有多項優(yōu)點，EVs能夠穿透多種生理屏障[21]。此外，使用MSC-EVs可避免干細胞導致的一些并發(fā)癥——異位腫瘤形成、肺微血管內(nèi)陷等。這些優(yōu)勢均表明MSC-EVs是一種值得發(fā)掘的治療手段。

2 MSC-EVs調(diào)節(jié)IBD腸道免疫

腸道適應(yīng)性免疫和固有免疫功能缺失或異常在IBD的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。過去，大多數(shù)研究集中在適應(yīng)性免疫失常在IBD中的作用。近期全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)和免疫學研究取得進展，發(fā)現(xiàn)腸道黏膜固有免疫異常在IBD患者中普遍存在。

2.1 MSC-EVs調(diào)節(jié)腸道固有免疫巨噬細胞已被確定為誘導結(jié)腸炎癥最關(guān)鍵的細胞，能夠在受損的上皮細胞中釋放大量與損傷相關(guān)的分子模式(DAMP)以激活結(jié)腸巨噬細胞中的NF-κB信號通路，從而導致一氧化氮合酶(iNOS)的表達和炎性細胞因子的分泌增強，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、一氧化氮(NO)、淋巴細胞和單核細胞招募趨化因子(CCL-17和CCL-24)[22]。巨噬細胞源性TNF-α和IL-1β誘導增強E和P選擇素在內(nèi)皮細胞上的表達使循環(huán)單核細胞大量流入受損腸道內(nèi)的淋巴細胞。巨噬細胞來源的CCL-17和CCL-24吸引促炎M1巨噬細胞，并產(chǎn)生分泌IFN-γ的CD4+Th1細胞，間接促進結(jié)腸損傷和腸道炎癥。在接受MSC-EVs治療的DSS小鼠的腸道中，巨噬細胞來源的炎性細胞因子和趨化因子(TNF-α、CCL-17和CCL-24)和Th1分泌的IFN-γ的表達明顯減弱。體外實驗證實了MSC-EVs進入了脂多糖(LPS)激活的結(jié)腸巨噬細胞中，抑制了炎癥細胞因子的產(chǎn)生，并且誘導免疫抑制M2表型的產(chǎn)生[23]。MSC-EVs在抗炎性M2表型中誘導結(jié)腸巨噬細胞極化，表現(xiàn)為免疫抑制細胞因子TGF-β和IL-10的分泌增加，促進了Treg細胞的增殖。此外，MSC-EVs還通過抑制結(jié)腸巨噬細胞中的IL-7信號傳導在結(jié)腸炎中發(fā)揮有益作用。由此可知，MSC-EVs治療顯著降低了結(jié)腸巨噬細胞中IL-7和iNOS信號通路的活化，導致TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌減少而IL-10的分泌增加，從而減輕結(jié)腸炎癥[24]。

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是專業(yè)的抗原提呈細胞，負責T細胞活化和誘導適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是固有免疫和適應(yīng)性免疫之間關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵參與者。DC通過細胞間通訊和細胞因子的分泌途徑來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-12在幼稚T細胞分化的抗原提呈過程中發(fā)揮重要的誘導免疫反應(yīng)的作用。IL-12主要通過STAT4誘導T細胞IFN-γ產(chǎn)生，而DC是IL-12的關(guān)鍵生產(chǎn)者之一。有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs處理后的DC分泌的IFN-γ減少，這將引起Th1和Th2效應(yīng)T細胞的平衡變化[25]。在體外實驗中，DC的CCR7表達和向CCR7的配體CCL-21遷移的能力下降，這表明經(jīng)過MSC-EVs處理的DC可能由于無法向次級淋巴組織遷移導致體內(nèi)炎癥性T細胞反應(yīng)受到抑制，相反，促進Treg的增殖，發(fā)揮免疫抑制作用。

2.2 MSC-EVs調(diào)節(jié)腸道適應(yīng)性免疫適應(yīng)性免疫反應(yīng)由淋巴細胞(T細胞和B細胞)組成，當其激活后產(chǎn)生細胞因子和抗體。為了清除特定的抗原，Th0被激活，分化成Th1、Th2或Th17細胞，然而T細胞的反應(yīng)異常伴T細胞亞群的過度發(fā)育可導致炎癥的發(fā)生。

Th17是T細胞的子集，可以產(chǎn)生大量的IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22。Th17細胞和它的標志性細胞因子IL-17A在腸道炎癥中廣泛研究。研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者的腸道黏膜中IL-17A的表達水平更高，且IBD患者的結(jié)腸固有層含有更多的Th17和Th1/Th17細胞[26]。由此可知，Th17的過度激活是IBD發(fā)病的關(guān)鍵因素。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)，TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠的脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中，Th17細胞的比例顯著增加，而經(jīng)骨髓MSCs分離的EVs治療后，Th17的比例明顯降低。這表明MSC-EVs對TNBS誘導的Th17活化具有顯著的抑制作用，從而能夠緩解實驗性結(jié)腸炎大鼠的癥狀，MSC-EVs的調(diào)節(jié)作用可能與H3K27me3的甲基化和去甲基化不平衡有關(guān)。

Treg是CD4+T細胞的亞群，能夠特異性表達Foxp3，Treg通過抑制異常的免疫反應(yīng)，在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。Treg通過產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10和TGF-α，以及通過抑制逃脫了其他免疫耐受途徑的T細胞的增殖和活化來發(fā)揮其功能。研究發(fā)現(xiàn)，Treg在實驗性結(jié)腸炎中發(fā)揮抗炎作用，且與緩解期IBD患者相比，活動期IBD患者的外周血中幾乎無Treg。IBD的發(fā)病可能與Treg數(shù)量減少有關(guān)。Du等[28]將MSC-EVs與外周血單核細胞(PBMCs)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC-EVs可以上調(diào)PBMCs中抑制性細胞因子IL-10和TGF-β1的表達能力，從而促進Treg細胞的增殖和免疫抑制功能。

3 MSC-EVs減輕腸道上皮凋亡

腸道屏障除了參與消化與吸收營養(yǎng)外，還構(gòu)成了固有免疫系統(tǒng)的一部分，阻止了潛在有害抗原和微生物的入侵。腸道屏障缺損與多種疾病有關(guān)，包括IBD、結(jié)腸癌等。腸道通透性的相關(guān)研究表明，IBD患者腸道通透性較正常增加40%～50%，且腸道屏障缺損可能是IBD患者的早期癥狀之一[29]。腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC)通過緊密連接形成了腸道屏障，IEC具有強大的自我更新能力，從而維持腸道屏障的完整性。研究發(fā)現(xiàn)實驗性結(jié)腸炎小鼠的腸上皮細胞凋亡增加，如Nenci等[30]發(fā)現(xiàn)，缺乏NF-κB基因的小鼠產(chǎn)生慢性腸炎的幾率增加，NF-κB是參與IEC功能的關(guān)鍵分子，這些小鼠由于該基因的缺失導致腸上皮凋亡增加，從而導致腸屏障的破壞。同時，有研究證明從UC患者的結(jié)腸活檢中發(fā)現(xiàn)大量的凋亡小體[31]。綜上所述，推測IEC的細胞凋亡途徑在IBD的發(fā)病中起重要作用。

MSC-EVs可以通過減輕上皮細胞凋亡從而緩解IBD的癥狀。Yang等[32]發(fā)現(xiàn)，TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中caspase3、caspase8、caspase9的表達明顯升高，而經(jīng)MSC-EVs尾靜脈注射的大鼠結(jié)腸黏膜中c-caspase9、c-caspase8和c-caspase3的表達顯著降低。外在凋亡的發(fā)生取決于caspase8和caspase3的激活，caspase9則參與內(nèi)在凋亡途徑。由此可知，MSC-EVs可以抑制腸道上皮細胞的凋亡。

4 MSC-EVs作為藥物遞送的載體

EVs被認為是非免疫原性的納米囊泡，可以保護其內(nèi)容物免受血清蛋白酶和免疫系統(tǒng)的影響，從而傳遞信息并與其他細胞通信[33]。與其他合成的納米顆粒，如脂質(zhì)體不同的是，外泌體含有跨膜和膜錨定蛋白，使得其內(nèi)吞作用增強，從而有利于內(nèi)容物的運送[34-35]。廣泛的研究已針對利用外泌體作為各種疾病的治療傳遞物，使用外泌體本身或工程外泌體來增加特定藥物的穩(wěn)定性，可增強靶向性和裝載效率。MSC-EVs在安全性方面具有優(yōu)勢，因為它們被認為是非免疫原性的，可以降低同種異體宿主免疫排斥的風險。此外，外泌體可以通過內(nèi)皮層進行胞吞轉(zhuǎn)運來穿越血腦屏障以運送生物分子到腦實質(zhì)。與大多數(shù)納米藥物載體一樣，外泌體主要聚集在肝臟、肺臟和脾臟，但它們同樣也對自身來源的組織具有親和力。Keener[36]發(fā)現(xiàn)，從纖維肉瘤細胞收獲的外泌體被注射到荷瘤小鼠中后，這些囊泡被吸引到了腫瘤組織。這種歸巢特征意味著外泌體可以將更多的藥物運送到需要的部位，減少了潛在的不良反應(yīng)。且該研究表明，用囊泡包裹的阿霉素同樣可以使腫瘤縮小，且效果優(yōu)于單獨使用的藥物。除了天然外泌體外，還可以制備工程外泌體，如用電流或化學方法將需要裝載的治療藥物包裹進囊泡中，如RNA、蛋白質(zhì)等。研究人員確定了天然外泌體的RNA中可能負責包裝的代碼片段，發(fā)現(xiàn)復制這些編碼片段后外泌體的負載量增加了100倍，并計劃使用這項技術(shù)來制備包裹有阻斷血管形成的miRNAs的外泌體，來防止乳腺癌患者的癌細胞擴散。此外，外泌體在體內(nèi)的耐受性良好，因其為內(nèi)源性的生物納米囊泡，具有優(yōu)異的生物相容性。因此，外泌體可以作為安全有效的納米載體。

5 展望及臨床使用存在的問題

MSC-EVs在損傷修復和免疫調(diào)節(jié)中的作用使其成為一種極具吸引力的治療方法，且其在體內(nèi)循環(huán)中穩(wěn)定，具有明顯的歸巢特性，并且能夠穿越生物屏障，同時又避免了腫瘤形成等細胞治療的隱患，更具安全性。由于它們具有較高的穩(wěn)定性，在機體循環(huán)中能夠達到足夠的檢測濃度，根據(jù)其含有的蛋白質(zhì)和RNA能夠追溯到母體細胞，因此EVs又可以作為疾病診斷的生物標志物。目前關(guān)于MSC-EVs在IBD治療中的研究還較少，但其強大的免疫調(diào)節(jié)功能及作為納米載體的優(yōu)勢，使其在IBD治療中的前景讓人期待。

MSCs的未來還有許多值得探索的地方，接下來會出現(xiàn)大量相關(guān)的研究，而MSC-EVs將在其中占有主導地位。MSC-EVs的作用與MSCs類似，同時又避免了細胞治療的弊端，這為將來的生物療法提供了新的思路。盡管MSC-EVs在臨床前研究中取得了成功，但在臨床環(huán)境中使用這些EVs仍有一些問題需要解決：(1)大量生產(chǎn)、分離及儲存的方法，以及如何進行穩(wěn)定的冷鏈運輸；(2)精準地對囊泡進行定性、定量；(3)給藥方式、次數(shù)及劑量；(4)供體和組織來源的選擇等。這些問題正在逐漸地解決，如生產(chǎn)分離方式正在逐步優(yōu)化，此外還需要開展更加深入的研究，才能早日實現(xiàn)臨床應(yīng)用。